二甲双胍、塞来昔布对化学诱导异常隐窝病灶预防机制的研究

李达周，王　雯， 许斌斌， 王　蓉， 刘建强， 林克荣， 邹多武



二甲双胍、塞来昔布对化学诱导异常隐窝病灶预防机制的研究

李达周1，王雯1， 许斌斌1， 王蓉1， 刘建强1， 林克荣1， 邹多武2

目的探讨二甲双胍、塞来昔布对氧化偶氮甲烷(AOM)诱导的异常隐窝病灶(ACF)的预防机制。方法45只7周龄BALB/c雌性小鼠随机分为对照组、二甲双胍组、塞来昔布组3组，分别予腹腔注射AOM；同时对照组、二甲双胍组、塞来昔布组小鼠分别予生理盐水、二甲双胍、塞来昔布灌胃处理。每周监测小鼠体质量变化。6周后处死小鼠并分离结直肠组织，应用PCNA免疫组织化学染色及TUNEL染色的方法检测病变组织的增殖及凋亡的情况；使用ELISA检测小鼠空腹血糖、空腹胰岛素以评估小鼠胰岛素的抵抗状态。结果二甲双胍组和塞来昔布组的细胞增殖指数分别为(27.30±1.49)和(37.20±2.10)，显著低于对照组(56.20±1.93)(P<0.05)，二甲双胍对细胞增殖的抑制作用强于塞来昔布(P<0.05)；二甲双胍组和塞来昔布组的细胞凋亡指数分别为(7.70±1.25)和(7.00±1.05)，显著高于对照组(5.10±1.37)(P<0.05)；对照组、二甲双胍组、塞来昔布组的小鼠空腹血糖及胰岛素抵抗指数比较，差别无统计学意义(P>0.05)。结论二甲双胍、塞来昔布对大肠癌起到预防的作用，其机制可能与抑制细胞增殖及促进细胞凋亡有关；二甲双胍的作用明显优于塞来昔布。

二甲双胍； 磺胺类； 吡唑类； 结直肠肿瘤

随着我国饮食结构及生活方式的改变，大肠癌的死亡率升至第2位[1]，并成为发病率增长最快的肿瘤之一。大肠癌在一般人群中的发生率约为2%，在西方国家的发生率更是达到3%～4%[2]。尽管诊断及治疗水平不断提高，大肠癌的预后仍然较差。因此，积极预防和治疗癌前病变对提高疗效及节省医疗费用具有重要意义。

异常隐窝病灶(aberrant crypt foci，ACF)是在1987年由Bird在制作结肠癌小鼠模型时发现的[3]，随后的研究认为，ACF是结直肠肿瘤的最早期癌前病变，因为其参与了ACF—腺瘤—腺癌序列的演变，所以使用化学诱导的ACF动物模型可以用来评估药物对大肠癌预防的疗效及其机制[4]。

许多研究已经证实一些药物具有化学预防作用，如补充纤维素、阿司匹林、非甾体类抗炎药和选择性环氧合酶2(cyclooxygenase-2,COX-2)抑制剂等[5]。已有研究证实 ，塞来昔布、二甲双胍可以预防ACF，且二甲双胍预防作用更佳，但是其具体机制仍不明确。本研究旨在探讨二甲双胍、塞来昔布二者对化学诱导ACF的预防机制。

1　材料与方法

1.1动物6周龄SPF级的BALB/c雌性小鼠45只[上海斯莱克实验动物有限公司，SCXK(沪)2012-0002]。饲养于南京军区福州总医院比较医学科动物房，每日光照时间为12 h，保持基础饮食。

1.2方法

1.2.1ACF小鼠模型的建立小鼠适应环境1周后腹腔注射氧化偶氮甲烷(azoxymethane，AOM)(10 mg/kg)，每周1次，连续2周。

1.2.2分组采用完全随机方法，分为对照组、二甲双胍组及塞来昔布组,各15只。干预措施及剂量：在腹腔注射氧化偶氮甲烷的同时开始药物干预，对照组予生理盐水灌胃处理；二甲双胍组、塞来昔布组分别予二甲双胍250 mg·kg-1·d-1、塞来昔布20 mg·kg-1·d-1灌胃处理；干预期间小鼠保持基础饮食。

1.2.3观察指标每周定时监测体质量并记录。治疗6周后，小鼠空腹12 h后予抽血后处死，分离大肠组织，作如下研究：

1.2.3.1细胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen，PCNA)免疫组织化学染色将烘烤后的切片予脱蜡与复水；柠檬酸盐抗原修复液高温高压抗原修复；将上述切片浸泡于PBS液中，采用免疫组织化学专用油笔在距组织周围2 mm处划圈，以PBS液洗涤；室温条件下将组织切片浸泡于3%H2O2液中，继续用PBS液冲洗；切片上直接加入已稀释的兔抗小鼠PCNA一抗后，放入4 ℃冰箱中过夜；甩去多余液体后滴加二步法试剂盒中Polymer Helper，常温下隔水式恒温烤箱孵育20 min；滴加试剂盒中相应辣根酶标记抗兔二抗，37 ℃孵育30 min；DAB显色；复染、脱水、透明、封片，切片进行镜检。

PCNA染色判断标准：PCNA以细胞核发现棕黄色为阳性信号。高倍镜下随机选择10个视野，每个视野计数100个细胞，计算细胞增殖指数(proliferation index,PI)：

PI=(阳性细胞数÷细胞总数)×100%

1.2.3.2转移酶介导的脱氧尿苷三磷酸生物素缺口末端标记(transferase-mediated deoxyuridine triphosphate-biotin nick end labeling，TUNEL)方法同PCNA。TUNEL法中凋亡细胞胞核呈棕色至棕褐色深染，形态不整，大小不一，正常细胞为蓝紫色。每张切片随机选取5个高倍视野。计算凋亡指数(apoptosis index,AI)：

AI=(凋亡细胞数÷细胞总数)×100%

1.2.3.3酶联免疫吸附测定法(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)检测小鼠空腹血糖、空腹胰岛素分别将标本或不同浓度标准品(每孔10 μL)加入相应孔中，快速加入HRP连接抗体工作液(每孔100 μL)；用封板胶纸封住反应孔，室温孵育120 min；洗板5次，且最后一次置厚吸水纸上拍干；加入显色剂TMB每孔100 μL，避光室温孵育10 min；加入终止液每孔50 μL，混匀后即刻测量OD450值。

严格按照上述操作方法检测FINS。再应用稳态模式评估法(homeostasis model assessment,HOMA)中的HOMA-IR公式评估胰岛素抵抗(insulin resistance，IR)水平：

HOMA-IR=FPG(mmol/L)×FINS(mU/L)/22.5

2　结　果

2.1大肠上皮细胞凋亡及增殖情况小鼠病变组织的凋亡与增殖情况分别由TUNEL染色及PCNA染色检测，二甲双胍组和塞来昔布组的AI分别为(7.70±1.25)和(7.00±1.05)，高于对照组的(5.10±1.37)(P<0.05)。二甲双胍组和塞来昔布组的PI分别为(27.30±1.49)和(37.20±2.10)，低于对照组(56.20±1.93)(P<0.05)，且二甲双胍对细胞增殖的抑制作用显著强于塞来昔布(P<0.05)。上述结果显示了2种药物对ACF均有较为明显的诱导凋亡及抑制增殖的作用(图1)。

2.2小鼠ACF及AC数量经二甲双胍和塞来昔布干预后的小鼠ACF分别为(3.67±0.58)和(5.60±0.89)，其AC数量分别为(8.33±0.58)和(13.40±1.67)，而未经药物干预的对照组小鼠ACF及AC数量分别为(8.80±0.84)和(26.75±2.63)，3组两两比较差别有统计学意义(P<0.05)。

2.3干预后小鼠的血糖及IR干预6周后，对照组、二甲双胍组和塞来昔布组3组小鼠的空腹血糖比较，差别无统计学意义(H=0.285，P=0.867)；3组的IR比较，差别无统计学意义(H=1.62，P=0.445)，单独使用二甲双胍不会引起低血糖反应，且二甲双胍并不会对正常小鼠的胰岛素水平产生影响(图2)。

3　讨　论

COX-2抑制剂药物塞来昔布相较于非选择性非甾体类抗炎药，其引起胃肠道不良反应较少。动物实验证实，塞来昔布可减少ACF数量，进而对结直肠癌起到化学预防作用[6]。本实验发现，塞来昔布通过抑制细胞的增殖及促进细胞的凋亡，从而起到预防ACF的作用，虽然作用机制还不明确，但是现有的研究考虑其主要是通过抑制COX-2来发挥作用。

二甲双胍的抗癌作用机制复杂，可能与其全身性作用(间接)和局部性作用(直接)有关。有研究显示，高胰岛素血症与某些肿瘤的不良预后有关[7]，二甲双胍可能通过降低血液中的胰岛素水平、改善胰岛素抵抗，从而间接地抑制肿瘤发生发展。但是本实验中血清指标显示，对照组和二甲双胍组二者之间的空腹胰岛素以及HOMA-IR差别无统计学意义，说明在正常小鼠即非糖尿病模型小鼠中，二甲双胍并不是通过全身性作用发挥其抗癌疗效的。因此，在预防正常个体结直肠癌方面，二甲双胍可能主要通过其局部的直接作用起到抗癌的作用。本实验中发现，二甲双胍可以通过抑制细胞增殖和促进细胞凋亡来减少ACF的形成，且二甲双胍在抑制细胞增殖方面较塞来昔布更强，其预防作用更佳。一些研究发现，激活的腺苷酸活化蛋白激酶(adenosine monophosphate activated protein kinase，AMPK)可能在肿瘤的生长增殖、细胞周期及凋亡等多过程中发挥作用[8-9]；而目前普遍认为，二甲双胍可能主要通过激活AMPK/mTOR通道来直接抑制肿瘤的生长。本实验中，二甲双胍可能也是通过激活AMPK来达到其抑制ACF的作用。当然，其局部性作用除AMPK依赖途径以外，还存在一些非AMPK依赖的抗肿瘤途径，如氨基酸可通过Rag GTPases激活mTORC1信号[10]，二甲双胍能够通过使Regulator复合物失活来抑制mTORC1信号，从而模仿氨基酸戒断的影响[11]。因此，在二甲双胍抗肿瘤机制方面仍有待进一步的深入研究。

本研究显示，二甲双胍、塞来昔布均可抑制病变组织的增殖及促进其凋亡，进而影响癌前病变的发生发展达到预防的目的。虽然二者具体机制仍有待研究，但是其在抑制细胞增殖及促进细胞凋亡方面作用得到证实，且二甲双胍的作用明显优于塞来昔布，进一步显示了其应用于结直肠癌预防的广阔的前景。

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[3]Bird R P. Observation and quantification of aberrant crypts in the murine colon treated with a colon carcinogen: preliminary findings[J].CancerLett,1987,37(2):147-151.

[4]Raju J. Azoxymethane-induced rat aberrant crypt foci：Relevance in studying chemoprevention of colon cancer[J].WorldJGastroenterol, 2008,14(43):6632-6635.

[5]Lang M, Gasche C. Chemoprevention of colorectal cancer[J].DigDis, 2015,33(1):58-67.

[6]李军,吕愈敏,金珠,等. 塞来昔布对二甲基肼诱导的大鼠畸变隐窝灶的预防作用[J]. 中华消化杂志,2004,24(3):151-153.

[7]Pollak M N. Investigating metformin for cancer prevention and treatment:the end of the beginning[J].CancerDiscov, 2012,2(9):778-790.

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[9]Jansen M,Ten Klooster J P,Offerhaus G J,etal. LKB1 and AMPK family signaling:the intimate link between cell polarity and energy metabolism[J].PhysiolRev, 2009,89(3):777-798.

[10]Efeyan A,Zoncu R,Chang S,etal. Regulation of mTORC1 by the Rag GTPases is necessary for neonatal autophagy and survival[J].Nature, 2013,493(7434):679-683.

[11]Pierotti M A,Berrino F,Garibolhi M,etal. Targeting metabolism for cancer treatment and prevention: metformin, an old drug with multi-faceted effects[J].Oncogene, 2013,32(12):1475-1487.

(编辑:张慧茹)

Chemopreventive Mechanism of Metformin or Celecoxib on Chemically Induced Colorectal Aberrant Crypt Foci in Mice

LI Dazhou1, WANG Wen1, XU Binbin1, WANG Rong1, LIU Jianqiang1, LIN Kerong1, ZOU Duowu2

1.Department of Gastroenterology, Fuzhou Genera Hospital of Nanjing Military Command,Fuzhou Clinical Medical College of Second Military Medical University,Fuzhou 350025,China;2.Department of Gastroenterology,Changhai Hospital, Second Military Medical University,Shanghai 200433,China

ObjectiveTo investigate chemopreventive mechanism of metformin or celecoxib on chemically induced colorectal aberrant crypt foci in mice.MethodsForty five 6-week-old BALB/c female mice were randomly divided into 3 groups: control group, metformin group and celecoxib group.After one week adaptation, the mice were injected intraperitoneally with 10 mg/kg of AOM, once a week for two weeks.The mice in control group, metformin group and celecoxib group were treated with saline, metformin and celecoxib by gavage, respectively.The changes in body weight were monitored weekly in mice.After 6 weeks, mice were sacrificed and the colorectal tissues were separated.Proliferation of lesions tissue was detected by proliferating cell nuclear antigen (PCNA) labeling indices, and apoptosis was detected by transferase deoxynucleotidyl uridine end labeling (TUNEL) staining.Moreover, to assess the state of mice insulin resistance, the fasting plasma glucose and insulin in mice were detected.ResultsThe proliferation index (PI) of metformin group and celecoxib group were respectively (27.30±1.49) and (37.20±2.10)，which was lower than that of the control group (56.20±1.93), (P<0.05).Metformin had stronger inhibitory effect than celecoxib on cell proliferation (P<0.05).The apoptosis index (AI) in metformin group and celecoxib group were (7.70±1.25) and (7.00±1.05) respectively, which was higher than that in the control group (5.10±1.37), (P<0.05).No significant difference in fasting plasma glucose and insulin resistance index of mice was found between control group, metformin group and celecoxib group (P>0.05).ConclusionWe confirm that metformin and celecoxib may play a preventive role for colorectal cancer.The mechanism may be related to the inhibition of cell proliferation and promoting of apoptosis.Moreover, the effect of metformin is better than celecoxib.

metformin; sulfonamides; pyrazoles; colorectal neoplasms

2016-01-08

福建省科技厅重点项目(2014Y0038)

李达周(1973-),男,副主任医师，医学硕士

1.第二军医大学 福州临床医学院，南京军区福州总医院 消化科，福州350025；2.第二军医大学 附属长海医院消化科,上海200433

邹多武. Email: duowuzou@hotmail.com

R-332； R730.231； R735.34； R735.35； R735.37； R977.3； R979.3

A

1672-4194(2016)03-0163-04