闽产钩吻资源分布及药用部位的研究

石冬梅， 苏燕评， 吴宏霞， 俞昌喜



闽产钩吻资源分布及药用部位的研究

石冬梅1， 苏燕评2， 吴宏霞3， 俞昌喜4

目的调查福建省钩吻资源的分布情况，并确定钩吻的最佳药用部位。方法依据文献记载和实地考察闽产钩吻的生境与分布；正交设计试验优化超声提取钩吻素子的工艺条件，采用高效液相色谱法测定钩吻根、茎和叶中的钩吻素子含量。结果闽产钩吻资源主要集中分布于23°84′N～26°92′N、116°36′E～120°05′E、海拔800 m以下光照良好的山坡、路旁。超声提取钩吻素子的最佳条件为超声功率250 W、时间20 min、温度50 ℃、料液比1∶20。闽产钩吻根和茎的钩吻素子含量高，叶的含量较低。结论闽产钩吻分布较广，资源丰富；钩吻的入药部位以根和茎为佳。

福建； 钩吻； 分布； 高效液相色谱； 药用部位

钩吻(GelsemiumelegansBenth.)为马钱科胡蔓藤属常绿木质藤本植物，俗称断肠草、野葛、毒根、大茶药，全草入药[1]。我国对钩吻的使用历史悠久，《神农本草经》始有记载。民间一直应用钩吻原植物治疗各类疼痛，尤其是慢性神经性疼痛与癌性疼痛。生药钩吻中的主要成分钩吻素子有显著镇痛和治疗类风湿性关节炎的功效，具有良好的成药性[2-5]。目前钩吻素子获取的主要途径就是从原植物中提取分离。因此，如何获得钩吻药材、合理利用药材，将其资源价值最大化，值得广泛关注和深入研究。

从钩吻中提取生物碱多采用煎煮法、热回流等方法[6-8]。这些方法溶剂用量大、耗时长，不利于钩吻素子含量的快速检测。陈志惠等比较了索氏回流、常规浸提、超声波3种方法提取钩吻总碱，以超声波提取法得率最高[9]。本研究采用正交设计试验，优化超声提取钩吻素子的工艺条件；采用高效液相色谱法测定福建省不同产区钩吻的根、茎和叶的钩吻素子含量，以确定钩吻的最佳药用部位，为钩吻素子工业化生产提供药材及质量保证。

钩吻在我国主要分布在浙江、福建、广东、广西、湖南、贵州、云南省等地，福建省野生钩吻资源丰富[10]。为保证闽产钩吻资源的可持续性利用，对闽产钩吻进行分布和生境的调查，比较人工栽培不同年限钩吻中钩吻素子的含量，为钩吻药材生产质量管理规范(good agriculturing practice,GAP)的建设提供科学依据。

1　材料与方法

1.1材料

1.1.1药材样品2015年4-10月采于闽侯、永定、云霄和尤溪，并经笔者鉴定为马钱科胡蔓藤属植物钩吻。将不同产地的钩吻药材根、茎和叶分别收集干燥，粉碎，过3号筛，备用。

1.1.2药品及试剂钩吻素子对照品为本课题组前期提取分离精制而成，经高效液相色谱法鉴定，纯度为99.1%。甲醇(色谱纯)及氯仿、95%乙醇、氨水(均为分析纯)(中国国药集团化学试剂)；水为娃哈哈纯净水。

1.1.3仪器超声波清洗器(KQ-500E型，昆山市超声仪器有限公司)，高效液相色谱仪(1100LC型，美国Agilent公司)，电子天平(AR124CN型，奥豪斯仪器有限公司)，旋转蒸发器(RE5299，巩义市予华仪器有限责任公司)。

1.2方法

1.2.1钩吻资源分布调查方法(1)文献检索调查：收集有关钩吻的调查研究资料，了解闽产钩吻的分布情况。(2)实地调查：咨询相关方面专家、当地向导，查看钩吻标本的采集记录，确定调查地点和范围，记录钩吻的生境。

1.2.2钩吻素子含量测定

1.2.2.1色谱条件与系统适应性试验按照高效液相色谱法(《中华人民共和国药典一部》2010版附录ⅥD)测定。检测波长：256 nm；色谱柱：Phenomenex Kinetex EVO，250 mm×4.6 mm；流动相：甲醇-水-氨水(55∶45∶0.05)，流速：1.0 mL/min；进样量：10 μL；柱温：30 ℃。理论板数按钩吻素子峰计算不低于5 000。对照品、钩吻样品及空白溶液的色谱图见图1。

1.2.2.2对照品溶液的制备精密称取钩吻素子对照品适量，加甲醇制成0.400 0 g/L的溶液，摇匀即得。

1.2.2.3空白溶液的制备取0.8 mL的3% NaOH于表面皿中，过夜阴干，加20 mL氯仿，置具塞锥形瓶中，超声提取20 min(功率250 W，频率50 kHz，温度50 ℃)，重复3次，合并提取液，抽滤，滤液旋蒸至干，残渣用甲醇溶解并转移到10 mL容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，滤过，即得空白溶液。同样条件下进行检测，与对照品比较，无溶剂干扰峰。

1.2.2.4供试品溶液的制备取药材粉末(过3号筛)，60 ℃干燥4 h，精密称取0.300 0 g，用0.8 mL 3% NaOH润湿，过夜阴干，置具塞锥形瓶中，加20 mL氯仿，超声提取20 min(功率250 W，频率50 kHz，温度50 ℃)，重复3次，合并提取液，抽滤，滤液旋蒸至干，残渣用甲醇溶解并转移到10 mL容量瓶中，用甲醇稀释到刻度，摇匀，滤过，即得。

1.2.2.5线性关系考察精密吸取对照品溶液0.5，1.0，2.0，4.0，6.0，8.0 mL于10 mL容量瓶中，加甲醇至刻度，分别取10 μL注入高效液相色谱仪测定。以峰面积为纵坐标，对照品质量浓度(μg/mL)为横坐标作标准曲线，得回归方程Y=10 932X+759，r=0.999 4，线性范围为0.02～0.32 mg/mL(n=6)。

1.2.3超声波提取钩吻素子最佳工艺选择分别采用甲醇、95%乙醇和氯仿超声提取，按1.2.2的方法测定钩吻素子的含量，比较钩吻素子提取率，得适宜提取剂。为确定钩吻素子的最佳提取工艺，以钩吻素子的含量为考察指标，采用正交试验法，以超声提取时间、提取温度、提取功率和料液比设计L9(34)4因素3个水平正交表(表1)。

表1　正交试验因素与水平考察

2　结　果

2.1闽产钩吻资源分布文献资料显示，闽产钩吻主要分布在云霄、平和、上杭、永定、连城、永春、仙游、同安、闽侯、霞浦、福安等地。依据文献的记载及当地向导的指引选定9个地方作为钩吻生境考察点(表2)。闽产钩吻野生资源主要集中分布于23°84′N～26°92′N、116°36′E～120°05′E、海拔800 m以下光照充足的山地路边或山坡灌木丛中，喜生活在腐殖质或黄壤地带。云霄、上杭、永泰、尤溪钩吻分布较多，长势旺盛，直径>3 cm的植株较常见，多呈片状分布。龙岩、宁德一带有人为采挖的破坏现象，储量较以前减少。在调查野生资源过程中，发现有人工栽培钩吻，种植于大田和山坡，目前人工种植株约7万～8万株。

2.2超声提取钩吻素子的工艺优化

2.2.1提取溶剂的选择同一超声条件下，氯仿对于钩吻素子的提取率最高，因此选择氯仿作为提取剂(图2)。

2.2.2正交试验设计钩吻素子最佳提取工艺正交试验结果显示，极差R的大小顺序为C>D>B>A，即影响钩吻素子超声提取因素的主次关系依次为提取功率>提取时间>提取温度>料液比。4个因素中提取功率的影响最大，料液比的影响最小。超声法从钩吻中提取钩吻素子的最佳工艺条件为C2D2B2A2，即提取功率250 W、时间20 min、温度50 ℃、料液比1∶20(表3)。

表2　闽产钩吻野生生境状况

2.3不同产地钩吻素子含量的测定测量4个产地钩吻中钩吻素子的含量显示，钩吻根中的含量最高，平均为0.40%；茎中的含量居中，平均为0.24%；叶子的含量最低，平均为0.03%(表4)。

2.4人工栽培株钩吻素子含量的测定人工栽培钩吻有1年生的种苗和分别种植于大田、山坡的同批3年生植株。1年生钩吻种苗干燥根质量仅为1.605 g，茎为3.747 g，种苗根、茎中钩吻素子的总量分别为3.691，4.871 mg。经过3年的种植，3年生种植于大田和山坡的钩吻根、茎的干质量和钩吻素子含量均比1年生增加，山坡种植钩吻根、茎的干质量增加到18.738，51.375 g，茎中钩吻素子的总量高达87.338 mg，比1年生的种苗茎中的总量增加了17倍。3年生大田种植株茎的干质量为43.470 g，钩吻素子的含量为0.15%，干质量和含量均略低于3年生山坡种植株(表5)。

表3　正交试验结果

表4　不同产地同一植株根、茎和叶中钩吻素子的含量

表5　1年生和3年生药材钩吻素子的含量

3　讨　论

福建省野生钩吻资源主要集中分布于23°84′N～26°92′N、116°36′E～120°05′E、海拔800 m以下光照良好的山坡、路旁，呈点状或片状分布。腐殖质土壤土层深厚，有机营养高，有利于钩吻的生长。由于钩吻可用于治疗鱼病和猪复壮[11]，野生钩吻常被连根采挖，有些地区如龙岩上杭、永定，资源受到较大的破坏；闽东南地区在山坡开垦种植果园时常将钩吻除去，致使闽产钩吻的分布范围缩小，产量下降。为满足日益扩大兽药的需求，闽西地区有小面积的人工种植钩吻。

人工种植1年生钩吻根中钩吻素子的含量已高于0.2%、茎中的钩吻素子含量也高于0.1%，但由于植株较小、质量轻，钩吻素子的总量较低；随着生长年限的增加，钩吻根、茎的质量增加，3年生山坡种植株茎中钩吻素子的总量高达87.338 mg，比1年生植株茎的含量增加了17倍，钩吻素子的含量呈上升趋势。但由于目前人工栽培的年限较短，仅有1年生和3年生的药材，无法获得栽培时间更长的样品，钩吻素子在钩吻体内的累积趋势暂时无法获知，需进一步跟踪研究。比较了同批分别种植于山坡和大田的植株，山坡种植株根、茎的干质量以及钩吻素子的含量均高于大田种植株，原因可能是钩吻为蔓生性藤本植物，山坡种植株间距较宽，且排水优于大田，生境更接近于钩吻的野生状态，因此产量和含量要优于大田栽培株。建议钩吻的人工种植选地为向阳山坡、株距稍宽为宜。

超声提取法相对于传统的热回流等方法具有简单、时间短、提取率高等特点，是天然药物提取的一个发展趋势。陈志惠等在超声提取钩吻总碱时设置提取温度为70 ℃，由于氯仿的沸点为61 ℃，在实际操作中，用70 ℃氯仿超声提取较困难，所以在提取温度的水平上设置最高温度为60 ℃。用超声提取对不同产地的钩吻根、茎和叶的钩吻素子含量测定表明，闽产钩吻的根、茎和叶中均含有钩吻素子，这与陈卫琳等报道闽产钩吻叶中不含钩吻素子不符[12]。钩吻素子在钩吻根中的含量最高，茎次之，叶子的含量最低。以云霄产钩吻为例，根、茎、叶子中的含量分别为0.38%，0.21%，0.03%；根、茎中钩吻素子的含量均比叶子高出7倍以上。鉴于叶子钩吻素子含量低、采收困难及含大量叶绿素不利于提纯等因素，钩吻的入药部位以根和茎为佳。

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(编辑:何佳凤)

Geographical Distribution of Gelsemium elegans in Fujian Province and the Medicinal Value of the Parts of the Plant

SHI Dongmei1, SU Yanping2, WU Hongxia3, YU Changxi4

1. Department of Natural Medicine; 2. Department of Pharmacochemistry; 3. Experiment Center； 4. Department of Pharmacology,College of Pharmacy, Fujian Medical University, Fuzhou 350108, China

ObjectiveTo investigate the distribution ofGelsemiumelegansin Fujian province and assay the content of koumine from different parts ofGelsemiumelegansto determine the optimal medicinal parts.

MethodsLiterature research and field survey were both done to investigate the distribution; The ultrasonic extraction conditions of koumine were optimized by orthogonal test.HPLC analysis was performed to assay the content of koumine from roots, stems and leaves ofGelsemiumelegans.ResultsIn 23 84′N to 26 92′N and 116 36′E to 120 05′E were the main production areas ofGelsemiumelegansin Fujian province.Vertical level was under 800 m.The optimum ultrasonic extraction conditions were as follows: 250 W ultrasonic power, 20 min ultrasonic time, 50 ℃ temperature and 1∶20 solid-liquid ratio.The contents of koumine from roots and stems were higher than leaves.ConclusionFujian province has widespread distribution and rich amount of resource ofGelsemiumelegans.Medicinal parts ofGelsemiumelegansare roots and stems.

Fujian；Gelsemiumelegans; distribution; high pressure liquid chromatography; medicament portions

2016-01-13

福建省教育厅产学研项目(JA14132)

福建医科大学 药学院，福州3501081. 天然药物学系；2. 药物化学系；3. 实验中心；4. 药理学系

石冬梅(1975-)，女，讲师，理学硕士

俞昌喜. Email: changxiyu@fjmu.edu.cn

R931.71; R282.71; R284.1

A

1672-4194(2016)03-0159-05