青春早期SD雌性大鼠在阿霉素肾病模型过程中生长发育的变化

刘俊朝，　和永瑞，　薛媛媛，　孙雯，　俞建，　汪永红，　时毓民



实验论著

青春早期SD雌性大鼠在阿霉素肾病模型过程中生长发育的变化

刘俊朝，和永瑞，薛媛媛，孙雯，俞建，汪永红，时毓民

目的观察青春早期SD雌性大鼠在阿霉素肾病模型过程中生长发育的变化。方法选取4周龄SPF级雌性SD大鼠10只，随机分为观察组和对照组各5只。观察组大鼠经尾静脉注射阿霉素6.5 mg/kg制备肾病模型，对照组大鼠经尾静脉注射等量生理盐水。观察阿霉素注射后1、2、3、4周SD大鼠体质量、子宫湿重、头尾长、胫骨长度变化及测定24 h尿蛋白；透射电镜下观察足细胞超微结构变化；放射免疫法分析血清雌二醇(E2)、促黄体生成素(LH)、促卵泡生成素(FSH)、胰岛素样生长因子1(IGF-1)、胰岛素样生长因子结合蛋白3(IGFBP-3)的变化。结果阿霉素注射后4周青春早期SD雌性大鼠尿蛋白显著高于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)。青春期雌性SD大鼠在阿霉素注射后足细胞足突融合逐渐加剧，在阿霉素注射后4周雌性SD大鼠肾小球足细胞足突出现广泛融合。观察组体质量在阿霉素注射后2、3、4周减轻逐渐加剧，与对照组比较差异有统计学意义(P<0.05)。观察组头尾长在阿霉素注射后4周较对照组明显减少，差异有统计学意义(P<0.05)。观察组胫骨长度和子宫湿重在阿霉素注射后2、3、4周后与对照组比较无明显减少，差异无统计学意义(P>0.05)。观察组血清LH、FSH、E2、IGF-1和IGFBP-3在阿霉素注射后2、3、4周与对照组比较无明显改变，差异无统计学意义(P>0.05)。结论青春早期雌性SD大鼠在阿霉素肾病模型过程中未出现明显的生长发育迟滞，血清生长相关激素和性激素分泌未出现明显降低。

肾病综合征；青春早期；阿霉素肾病；生长发育；大鼠

原发肾病综合征是儿童最常见肾脏疾病，激素是治疗肾病综合征的主要药物，生长迟缓是肾病综合征儿童面临的一个重要问题，但患儿生长迟缓是否与激素有关存在不同观点，本实验通过观察青春早期SD雌性大鼠在阿霉素肾病模型过程中的生长发育，了解阿霉素肾病过程中青春早期SD雌性大鼠的生长发育变化是否与疾病本身有关。

1　材料与方法

1.1材料SPF级雌性SD大鼠10只，4周龄，体质量70～80 g，购于斯莱克实验动物中心，动物许可证号为SYXK(沪)2010-0098；10只SD大鼠按随机数字表法分为观察组和对照组各5只。

1.2方法青春早期雌性SD大鼠阿霉素肾病模型的建立：观察组大鼠经尾静脉注射阿霉素(Pharmacia&Upjohn)6.5 mg/kg，对照组大鼠经尾静脉注射等量生理盐水；分别观察阿霉素注射后1、2、3、4周SD大鼠体质量、子宫湿重、头尾长、胫骨长度变化；留取1、2、3、4周SD大鼠24 h尿液用于测量24 h尿蛋白。

取SD大鼠肾皮质，切1 mm×1 mm×1 mm大小，放入戊二醛固定，然后依次锇酸固定、梯度乙醇脱水、环氧树脂包埋、超薄切片、醋酸-双氧铀和枸橼酸铅染色，透射电镜下观察足细胞超微结构变化。

放射免疫法：用放射免疫法测定血清雌二醇(estradiol，E2)、促黄体生成素(luteinizing hormone，LH)、促卵泡生成素(follicle stimulating hormone，FSH)、胰岛素样生长因子1(insulin-like growth factor 1，IGF-1)、胰岛素样生长因子结合蛋白3(insulin-like growth factor binding protein 3，IGFBP-3)水平，将标准品和大鼠血清、标记抗原和抗血清依次加入试管中,37 ℃下孵育，然后加入二抗，混匀，室温下孵育后在4 ℃ 3 500 r/min离心，离心半径8 cm，弃上清，用计数仪测定血清计数/分(cpm)值，根据标准曲线计算各标本浓度。

2　结果

2.1青春早期雌性SD大鼠阿霉素肾病过程中尿蛋白变化见表1。

表1　阿霉素注射后青春早期雌性SD大鼠在不同时间尿蛋白的变化

注：与对照组比较，at=10.42，P<0.05。

表1结果表明，阿霉素注射后1、2、3周青春早期雌性SD大鼠尿蛋白无明显增加，与对照组比较，差异无统计学意义(P>0.05)；阿霉素注射后4周青春早期SD雌性大鼠尿蛋白显著高于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)。

2.2透射电镜下青春早期雌性SD大鼠阿霉素肾病过程中足细胞损伤情况见图1。

图1　青春早期雌性SD大鼠在阿霉素注射后不同时间内肾小球足细胞损伤程度的比较(透射电镜×3 500)

图1可见青春期雌性SD大鼠在阿霉素注射后足细胞足突融合逐渐加剧，在阿霉素注射后4周雌性SD大鼠肾小球足细胞足突出现广泛融合。

2.3青春早期雌性SD大鼠阿霉素肾病过程中的生长发育SD大鼠阿霉素肾病中的体质量和子宫湿重变化见表2。头尾长和胫骨长度变化见表3。

表2　青春早期雌性SD大鼠阿霉素肾病中的体质量和子宫湿重变化±s，g)

注：与对照组比较，at=2.66，3.88，3.71，P<0.05。

表3　青春早期雌性SD大鼠阿霉素肾病中头尾长和胫骨长度变化±s，cm)

注：与对照组比较，at=2.99，P<0.05。

表2，3结果表明，观察组体质量在阿霉素注射后1周较对照组无明显减轻，差异无统计学意义(P>0.05)；而在2、3、4周体质量的减轻逐渐加剧，与对照组比较差异有统计学意义(P<0.05)。观察组头尾长在阿霉素注射后1、2、3周与对照组比较无明显减少，差异无统计学意义(P>0.05)，但在4周较对照组明显减少，差异有统计学意义(P<0.05)。观察组胫骨长度和子宫湿重在阿霉素注射后2、3、4周后与对照组比较无明显减少，差异无统计学意义(P>0.05)。

2.4青春早期雌性SD大鼠在阿霉素肾病过程中性激素及生长相关激素的变化见表4，5。

表4　青春早期雌性SD大鼠阿霉素肾病中血清LH、FSH和E2变化±s)

表5　青春早期雌性SD大鼠阿霉素肾病中血清IGF-1和IGFBP-3变化

表4，5结果表明，观察组血清E2、LH、FSH、IGF-1、IGFBP-3在阿霉素注射后2、3、4周与对照组比较无明显改变，差异无统计学意义(P>0.05)。

3　讨论

肾病综合征是儿童最常见的肾脏疾病，部分患儿最终身高受到影响，有研究认为激素敏感的肾病综合征患儿长期激素治疗对男孩身高影响较大，而对女孩身高无明显影响[1]。

本研究选择青春早期SD雌性大鼠，通过观察阿霉素肾病模型病程中雌性SD大鼠的生长发育情况，结果发现青春早期SD雌性大鼠在阿霉素注射后4周尿蛋白最明显，体质量随着时间的延长减轻越明显，青春早期雌性SD大鼠在阿霉素注射后第4周后的头尾长明显小于对照组，青春早期雌性SD大鼠胫骨长度在阿霉素注射后的4周内较对照组无明显减少。

Skrzypczyk等[2]研究显示，61例肾病综合征随访患儿中，激素治疗后女孩的月经初潮年龄平均在(12.9±1.4)岁，本研究显示青春早期雌性SD大鼠在阿霉素注射后2、3、4周大鼠子宫湿重较对照组无明显减轻。

女孩生殖系统在下丘脑-垂体-性腺轴作用下发育成熟，下丘脑-垂体-性腺轴包括下丘脑、垂体、卵巢、子宫、输卵管，各器官彼此之间存在信号反馈。下丘脑-垂体-卵巢系统在妊娠12周已经形成，至出生时已经具有完整的功能[3-4]；下丘脑在青春期发育过程中具有重要作用，下丘脑分泌的GnRH调控FSH、LH分泌，下丘脑结节中的弓状核内分泌GnRH的神经元数目最多[5]，儿童期间歇性分泌少量GnRH，使血清LH、FSH含量很低，至青春期，GnRH分泌增加，导致LH、FSH水平增加，而FSH、LH直接作用于性腺，促进卵泡发育成熟[6-7]。GH-IGF轴在胚胎和生后的过程中参与调控了机体的生长和代谢，GH与跨膜受体结合后进一步调控IGF-1基因转录，循环中IGFBPs将循环中IGFs转运至相关组织中发挥IGFs的作用，其中IGFBP-3和IGF-1结合后转运IGF-1至组织中发挥IGF-1的作用，而IGF-1在调控骨骼发育中起关键作用[8-11]。本研究进一步分析了青春早期雌性SD大鼠在阿霉素注射后不同时间点生长发育激素的变化，结果显示阿霉素注射后2、3、4周青春早期雌性SD大鼠血清LH、FSH、E2、IGF-1、IGFBP-3较对照组均无明显降低。

综上所述，青春早期SD大鼠在注射阿霉素后的发病过程中生长发育未发生明显延缓，血清LH、FSH、E2、IGF-1、IGFBP-3未发生明显变化。

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(本文编辑：刘颖)

Development and growth of female rats in early puberty with adriamycin-induced nephropathy

LIUJunchao，HEYongrui，XUEYuanyuan，SUNWen，YUJian，WANGYonghong，SHIYumin.

Children'sHospitalofFudanUniversity，Shanghai201102，China.

ObjectiveTo observe the development and growth of female SD rats in early puberty with adriamycin-induced nephropathy.MethodsTen SPF female SD rats, 4-week old, were randomly divided into experimental(5 rats) and control group(5 rats). The rats in experimental group were injected with adriamycin via the tail vein at the dosage of 6.5 mg/kg; the rats in the control group were injected with normal saline via the tail vein. The body weight, uterine wet weight, head-tail length, and tibia length were measured and 24h urinary protein was determined once a week for 4 weeks after injection. Ultrastructural change of podocytes was observed by transmission electron microscope. Serum level of estradiol(E2), luteinizing hormone(LH), follicle stimulating hormone(FSH), insulin-like growth factor 1(IGF-1), and insulin-like growth factor binding protein 3(IGFBP-3) were measured by radioimmunoassay.ResultsUrinary protein of the experimental group was significantly higher than that of the control group at the 4thweek after adriamycin injection(P<0.05). Podocyte foot process effacement was extensive at the 4thweek after adriamycin injection. Body weight of the experimental group was more significantly decreased than that of the control group at 2nd, 3rdand 4thweek after adriamycin injection than that of the control group(P<0.05). Head-tail length of the experimental group was significantly reduced compared with the control group(P<0.05) at the 4thweek after adriamycin injection, while tibia length and uterine wet weight showed no significant reduction after adriamycin injection compared with the control group(P>0.05). The serum level of LH, FSH, E2, IGF-1 and IGFBP-3 in the experiment group at the 2nd, 3rdand 4thweek after adriamycin injection was not significantly changed compared with the control group(P>0.05).ConclusionFemale SD rats in early puberty with adriamycin-induced nephropathy do not have obvious growth and development retardation; serum growth hormone and sex hormones are not significantly reduced.

Nephrotic syndrome;Early puberty；Adriamycin-induced nephropathy；Development and growth;Rat

国家自然科学基金(81574022)

201102 上海，复旦大学附属儿科医院中医科

刘俊朝(1974-)，男，医学博士，主治医师。研究方向：儿童肾脏疾病的中西医结合治疗

俞建，E-mail:yuj@shmu.edu.cn

10.3969/j.issn.1674-3865.2016.04.004

R726.9

A

1674-3865(2016)04-0383-04

2016-03-18)