儿童反复呼吸道感染外周血Th17细胞、唾液中分泌型免疫球蛋白A/白蛋白比值变化及其意义

张琳，　何德根，　陈慧



临床论著

儿童反复呼吸道感染外周血Th17细胞、唾液中分泌型免疫球蛋白A/白蛋白比值变化及其意义

张琳，何德根，陈慧

目的探讨儿童反复呼吸道感染(RRTIs)外周血Th17细胞、唾液中分泌型免疫球蛋白A(sIgA)与血清白蛋白(ALB)比值变化及其意义。方法2014年10月至2015年7月广州中医药大学附属中山市中医院儿科收治RTTIs患儿100例，其中急性期和缓解期各50例。同期选取门诊体检的健康儿童50例为正常对照组。流式细胞仪检测Th17细胞表达率，酶标仪检测唾液中sIgA，免疫比浊法检测ALB。结果RRTIs患儿急性期组、缓解期组外周血Th17细胞数较正常对照组患儿增高，差异有统计学意义(P<0.05)；RRTIs患儿急性期组外周血Th17细胞数高于缓解期组，差异有统计学意义(P<0.05)。外周血中Th17阳性细胞数与呼吸道感染严重程度呈正相关(P<0.05)。正常对照组唾液中sIgA与血清白蛋白比值显著高于RRTIs患儿急性期组、缓解期组，差异有统计学意义(P<0.05)；RRTIs患儿急性期组与缓解期组唾液中sIgA与血清白蛋白比值比较差异无统计学意义(P>0.05)。结论RRTIs患儿外周血Th17细胞表达增加，且与其病情的严重程度呈正相关。RRTIs患儿存在黏膜免疫功能低下，增强呼吸道免疫功能能从根本上减少RRTIs的发作。

反复呼吸道感染；Th17细胞；唾液分泌型IgA；免疫；儿童

儿童反复呼吸道感染(recurrent respiration tract infections，RRTIs)是儿科门诊常见的疾病，也是一种非常复杂的疾病。RRTIs病程中与气道高反应性、黏膜免疫功能紊乱、免疫功能低下密切相关[1]。分泌型免疫球蛋白A(secretory immunoglobulin A，sIgA)/白蛋白(albumin，ALB)能直接反映患儿呼吸道的黏膜免疫功能，外周血Th17细胞与病毒、细菌等感染密切相关[2-4]。本研究探讨RRTIs患儿唾液中sIgA/ALB、外周血Th17在病程急性期、缓解期与健康儿童的差异，探讨其与RRTIs患儿病程及病情轻重的关系，研究RRTIs的免疫学改变。

1　资料与方法

1.1临床资料2014年10月至2015年7月广州中医药大学附属中山市中医院儿科收治RTTIs患儿100例，其中急性期和缓解期各50例。RRTIs急性期组中男23例，女27例；年龄3～8岁，平均(5.4±2.4)岁。缓解期组中男28例，女22例；年龄3～8岁，平均(6.5±2.0)岁。同期选取门诊体检的健康儿童50例为正常对照组，其中男24例，女26例；年龄3～8岁，平均(5.9±2.2)岁。3组受试对象在年龄、性别方面比较差异无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。

1.2诊断标准参照中华医学会制定的《反复呼吸道感染的临床概念与处理原则》[5]进行诊断，RRTIs 1年以内上、下呼吸道感染频数超出正常范围。

1.3纳入标准(1)符合RRTIs的诊断标准；(2)年龄3～8岁；(3)患儿家属知情同意。

1.4排除标准(1)RRTIs急性期患儿患病超过3 d，标本收集前2周使用免疫抑制剂、免疫增强剂者；(2)RRTIs缓解期患儿近期有急性上呼吸道感染史，标本收集前2周使用免疫增强剂者；(3)正常对照组患儿有心肺及过敏性疾病、急性呼吸道感染等，标本收集前2周使用免疫抑制剂、免疫增强剂及激素类药物者。

1.5检测方法

1.5.1sIgA/ALB检测取所有研究对象上午10时唾液，具体方法如下：饮入漱口水或瓶装饮用水，用力漱口后，用一次性空针注射器抽取自然分泌唾液5～10 mL，将唾液置于试管内离心(2 000 r/min，离心15 min，离心半径8 cm)，取上清液于EP管内，将EP管保存于-20 ℃冰箱内待用。严格按购买试剂盒操作步骤说明进行检测。仪器：80-2型离心机(上海医疗器械有限公司)；Bio-Tek E13412E型全自动酶标仪(USA)；MDF-U5411型-20 ℃低温冰箱(SONY公司)；酶联免疫吸附法试剂盒(北京北方伟业生物技术有限公司)。抽取清晨空腹血2 mL，检测ALB，计算sIgA/ALB。

1.5.2Th17细胞检测新鲜的2 mL静脉血用等量的磷酸盐缓冲液(phosphate buffer saline，PBS)稀释，采用Ficoll密度梯度离心法(使用人淋巴细胞分离液由天津市灏洋生物制品有限责任公司提供)，分离外周血单个核细胞，调整细胞浓度至2×109/L，取2 mL细胞悬液，种植至24孔板(美国Costar公司)，加入0.05 mg/L佛波酯0.1 μg，1 mmol/L离子霉素2 μmol，1.4 mg/L莫能星2.8 μg。充分混匀后置于37 ℃，50 mL/L CO2培养箱中培养4～6 h，2 500 r/min，离心10 min，离心半径25 cm)，弃上清，PBS洗涤2次后，加入20 μL PE标记的鼠抗人CD4抗体(CD4抗体由美国Biolegend公司提供)。室温避光孵育30 min。PBS洗涤2次，固定液室温避光固定20 min后，3 000 r/min离心5 min，离心半径17.4 cm)，弃上清，PBS洗涤2次，加入破膜剂(室温避光孵育20 min后，3 000 r/min离心5 min，离心半径17 cm)，弃上清，PBS洗涤2次后，采用流式细胞仪检测。

2　结果

3组儿童外周血Th17细胞表达率、唾液中sIgA与血清白蛋白比值的检测结果见表1。

表1　3组儿童外周血Th17细胞表达率、唾液中sIgA与血清白蛋白比值的检测结果±s)

表1结果表明，RRTIs患儿急性期组、缓解期组外周血Th17细胞数较正常对照组患儿增高，差异有统计学意义(P<0.05)；RRTIs患儿急性期组外周血Th17细胞数高于缓解期组，差异有统计学意义(P<0.05)。外周血中Th17阳性细胞数与呼吸道感染严重程度呈正相关(r=0.838，P<0.05)，呼吸道感染越严重，外周血中Th17细胞表达越高。正常对照组唾液中sIgA与血清白蛋白比值显著高于RRTIs患儿急性期组、缓解期组，差异有统计学意义(P<0.05)；RRTIs患儿急性期组与缓解期组唾液中sIgA与血清白蛋白比值比较差异无统计学意义(P>0.05)。

3　讨论

RRTIs是一种小儿常见病，发病率高达20.3%[6]。RRTIs常见的原因有先天解剖因素、免疫缺陷、支原体感染、营养不良、微量元素缺乏等，其中RRTIs与儿童免疫功能低下密切相关已获共识[7]。研究表明，作为机体内因条件的免疫功能持续异常是RRTIs反复发生的主要病因[8]。黏膜是人体第一道免疫屏障，sIgA是在人体外分泌液中发现的一种IgA抗体，是人类黏膜免疫的主要抗体[9]。支气管黏膜是免疫系统的重要组成部分，其中最主要的是sIgA。sIgA多聚体的交叉连接效应可阻止微生物与上皮细胞受体之间的相互作用，从而封闭了其黏附到黏膜上皮细胞，进而入侵机体的致病途径[9]；而在选择性sIgA缺乏者，机体循环免疫复合物水平比正常人显著增高，易患消化道和呼吸道感染等的发生率也显著增高[10]。唾液中的sIgA可直接反映黏膜免疫功能状态，但受血液IgA漏出的影响，不宜作为直接的检测指标。由于尚无确切研究证明血液中的IgA与气管黏膜的sIgA有必然相关性，若单纯检测血液中的免疫球蛋白来评估黏膜免疫功能不具有充分的科学依据且暂无确切试验。ALB是维持血浆胶体渗透压的主要功能蛋白(大约构成80%的胶体渗透压)，ALB的浓度反映黏膜渗透性，因此，以唾液中sIgA与血液ALB浓度的比值作为检测指标，可以减少血液IgA漏出带来的检测误差，得到相对准确的结果。本研究发现，RRTIs患儿急性期、缓解唾液sIgA/ALB较正常儿童显著减少，反复的呼吸道感染导致sIgA合成障碍和免疫受损，向黏膜表面转运又受影响，这既是反复感染的结果，也是容易再次感染的原因。本研究中RRTIs患儿急性期、缓解期唾液sIgA/ALB并无明显变化，表明在患儿RRTIs期间，黏膜免疫功能持续低下，病情暂时缓解时，黏膜免疫功能并未改善。

Th17细胞是近年发现的一种新的效应性CD4+T细胞亚群[11]，其主要产生IL-17A、IL-17F等细胞因子[12]，故在宿主防御及炎症性疾病中起重要的作用。但在其对抗机体内多种细菌、真菌、病毒感染的同时，也可能通过炎症反应而引起病理性损伤[13]。本研究发现，RRTIs患儿Th17细胞表达率均高于健康对照组，且急性期增高更明显(P<0.05)。进行直线相关分析后发现，外周血中Th17细胞表达与呼吸道感染严重程度呈正相关(P<0.05)，呼吸道感染越严重，外周血中Th17细胞表达越高。说明RRTIs过程中，Th17细胞发挥了一定的抗感染效应，同时又可导致免疫损伤，引起呼吸道感染的反复发生。综上，RRTIs患儿体内存在Th17高表达，同时存在气道黏膜免疫下降，如能增强患儿的气道黏膜免疫功能，同时避免疾病过程中引起的进一步免疫损伤，就可缩短病程，改善预后。

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(本文编辑：刘颖)

Changes of Th17 cells in peripheral blood and the ratio of sIgA/ALB in saliva in children with recurrent respiratory tract infection and their significance

ZHANGLin，HEDegen，CHENHui.

DepartmentofPediatrics,ZhongshanHospitalofTraditionalChineseMedicine，Zhongshan528400，China.

ObjectiveTo observe and explore the significance and changes of Th17 cells in peripheral blood and ratio of sIgA/ALB in human saliva.MethodsA total of 100 RRTIs children were divided into two groups: acute group(n=50) and remission group(n=50).Another 50 normal healthy children were included as the control group. The expression rate of Th17 cells was detected by flow cytometry, the expression rate of sIgA in saliva was detected by enzymatic-reader,and the ALB was detected by immune turbidity method.ResultsThe circulating frequencies of Th17 cells in acute and remission group were higher than those in healthy control group(P<0.05), while those in acute group were higher than those in remission group(P<0.05).There were significantly difference in these groups(P<0.05). The circulating frequencies of Th17 cells were positively correlated with the severity of recurrent respiratory tract infection(P<0.05). The ratio of sIgA and serum albumin in saliva in healthy control group was significantly higher than that of acute group and remission group in RRTIs children(P<0.05),but that was no significant difference between acute and remission group(P>0.05).ConclusionThe circulating frequencies of Th17 cells in RRTIs children are increased, and are positively correlated with the severity of the RRTIs. The function of mucosal immune function in RRTIs children is low, so enhancing the immune function of the respiratory tract can fundamentally reduce the attack of RRTIs.

Recurrent respiratory tract infections(RRTIs);Th17 cells;SIgA in saliva;Immune;Child

中山市科技计划项目(2015B1207)

528400 广东 中山，广州中医药大学附属中山市中医院儿科

张琳(1978-)，女，医学硕士，副主任医师。研究方向:小儿肾病的中西医诊断与治疗

陈慧，E-mail：530656552@qq.com

10.3969/j.issn.1674-3865.2016.04.005

R725.6

A

1674-3865(2016)04-0387-03

2015-10-19)