三斑海马水提物抗氧化活性研究

陈莉萍,申铉日,*,陈国华,孙菲菲,金美娜

(1.海南大学食品学院,海南海口 570228;2.海南大学海洋学院,海南海口 570228)



三斑海马水提物抗氧化活性研究

陈莉萍1,申铉日1,*,陈国华2,孙菲菲1,金美娜1

(1.海南大学食品学院,海南海口 570228;2.海南大学海洋学院,海南海口 570228)

本文探讨三斑海马小分子水溶性提取物的抗氧化能力。以三斑海马干燥体粗粉为原料,经95%乙醇回流提取,系统溶剂提取获得不同极性提取物,并对水提物进一步分离及抗氧化活性评价。经Sephadex G-10凝胶过滤层析分离得到6个组分。对组分清除DPPH自由基,超氧阴离子自由基和羟基自由基能力,总还原力等抗氧化能力以及总氨基酸和总酚含量进行测定和评价。实验结果表明,在分离获得的6个组分中FrⅣ的DPPH自由基清除活性最高,其IC50=0.25 mg/mL。FrⅣ的总还原力较高,羟基自由基清除活性及铁离子螯合能力最强。表明三斑海马小分子水溶性提取物的抗氧化活性与总酚、总氨基酸、小分子肽的含量和类型密切相关。

三斑海马,水提物,抗氧化活性

三斑海马(HippocampustirmaculatusLeach)为脊索门鱼纲刺鱼目海龙科海马属的珍稀海洋硬骨鱼[1]。其体内含有多种生物活性物质,主要包括甾体类化合物、磷脂、氨基酸等[2],其功效为抗疲劳[3]、抗关节炎[4]、抗菌[5]。现代生命科学研究表明,活性氧簇/氮簇在人体中产生能引起氧化损伤和一些退行性疾病,如老化、癌症[6],抗氧化剂被认为是自由基清除剂。近年来,从天然产物获取天然抗氧化剂引起人们极大兴趣,在医药、人类营养和食品工业已受到广泛关注。目前,不同植物、动物来源水溶性组分中分离得到不同抗氧化活性成分。已有的海马研究工作主要集中在脂溶性成分的分析研究上[7],而对水溶性小分子的研究较少。

本研究以三斑海马为研究对象,探讨了其小分子水提物的分子量分布,评价其抗氧化活性,初步探讨了其分离物的组成成分与抗氧化活性之间的关系,以期提升三斑海马的药用价值。

1　材料与方法

1.1材料与仪器

三斑海马购自海南龙盛生物科技发展有限公司,干燥体。

DPPH自由基即1,1-二苯基-2-三硝基苯肼购自Sigma化学试剂公司;福林酚试剂国药集团,生化试剂。其他使用的化学品和试剂均为市售的分析纯。

7200可见光分光光度计尤尼柯上海有限公司;TU-1901双光束紫外可见光分光光度计北京普析通用仪器有限责任公司;TDL-60B离心机上海圣科仪器设备有限公司;EL204电子天平梅特勒-托利多仪器有限公司;M37610-33CN涡旋混合器赛默飞科技中国制造;DK-600电热恒温水温箱上海精宏实验设备有限公司;RE-5299旋转蒸发仪上海亚荣生化仪器厂;BT102S恒流泵保定雷弗流体科技有限公司;HD-5电脑紫外检测仪南京大学普阳科学仪器研究所;层析柱上海煊盛生化仪器有限公司。

1.2实验方法

1.2.1水提物制备与水提物分离三斑海马干品购自广州中药材市场,将样品用自来水冲洗并除去内脏等,60 ℃烘干至恒重,粉碎过20目筛,分析纯级95%乙醇以1∶10(m/v)比例,回流提取,每次提取2 h,重复三次,获得海马乙醇粗提取物。粗提液经真空泵布氏漏斗后抽滤,获得滤液,60 ℃下真空旋转蒸发浓缩至浸膏状。原料与去离子水1∶1(m/v)混悬。用系统溶剂萃取法,依次与相同体积的石油醚、乙酸乙酯、水饱和正丁醇萃取,各重复操作三次。获得四种组分(石油醚、乙酸乙酯、水饱和正丁醇、水),即极性从小到大的提取物。水提取物经旋转蒸发仪减压浓缩,冷冻干燥,计算水提取物的得率。水提取物用于进一步分离。使用前贮存于-20 ℃冰箱中。

水提取物通过葡聚糖凝胶G-10色谱柱进行分离,分析条件为,层析柱:1.2 cm×80 cm;填料:葡聚糖凝胶G-10(北京瑞达恒辉科技发展有限公司);检测波长:230 nm;进样量:50 mg/mL;进样体积:2.0 mL;洗脱溶剂:去离子水;流速:1.0 mL/min。

1.2.2总酚和总氨基酸含量的测定

1.2.2.1总酚含量的测定总酚含量测定采用修改的福林-乔卡梯奥(Folin-Ciocalteu)[8]方法,含量表示为mg EGCG/g组分。

1.2.2.2总氨基酸含量测定参照宁正祥[9]方法进行组分总氨基酸含量的测定,含量表示为mg甘氨酸/g组分。

1.2.3抗氧化活性测定

1.2.3.1DPPH·清除率测定参照Om P. Sharma等[10]的方法,配制浓度为0.1 mmol/L的DPPH·无水乙醇溶液。分别设置空白组、样品组、控制组。暗处反应20 min,分光光度计测定517 nm处的吸光值。VC作为阳性对照组。

DPPH·清除率根据以下公式计算:

式(1)

式(1)中,清除自由基能力表示为IC50(mg/mL),即抑制率为50%时的样品浓度。DPPH·清除能力较好的组分将进一步分析其他抗氧化活性。

1.2.3.2总还原力的测定参照江慎华[11]的方法。测定标准品维生素C阳性对照组的总还原力。

1.2.3.3羟自由基清除率的测定参照李莉等[12]的方法。10 mL试管中依次加入1.5 mmol/L邻二氮菲无水乙醇溶液1.0 mL、磷酸盐缓冲液(PBS,pH7.4)2.0 mL和去离子水1.0 mL,充分混匀,加入1.5 mmol/L FeSO4·7H2O溶液1.0 mL,边涡旋混合边加入,再加入0.015% H2O2溶液1.0 mL,置于37 ℃水浴中反应1 h,以体积比为2∶1的缓冲液和去离子水作为参比液,在510 nm处测定吸光度A1。用1.0 mL去离子水代替1.0 mL 0.015% H2O2,在510 nm测其吸光度A2;用不同浓度的样品代替1.0 mL双蒸水,在510 nm处测定吸光度A3,每次加样品充分摇匀。按式(2)计算抑制率:

式(2)

1.2.3.4铁离子螯合能力的测定参照Decker[13]的方法稍作修改。在1 mL不同浓度的小分子水提物组分溶液中依次加入3.7 mL去离子水、0.1 mL 2 mmol/L FeSO4·7H2O和0.2 mL 5 mmol/L菲咯嗪,混匀后置室温下20 min,562 nm处测定其OD值。每个样品平行测定3次,取其平均值。以去离子水作为空白对照,EDTA二钠盐作为阳性对照品。

根据式(3)计算提取物的Fe3+鳌合能力:

式(3)

式(3)中,A0为空白对照的OD值,A1为加有样品或者阳性对照后的OD值。

1.2.4统计学分析数据以平均数±标准偏差(x±S.D.)表示,OriginPro 7.5计算IC50,SPSS 17.0统计软件进行单因素差异分析。通过ANOVA进行数据间的差异分析,p<0.05,差异显著,p<0.01,差异极显著。

2　结果与分析

2.1三斑海马水提取物的分离

2.1.1三斑海马水提物Sephadex G-10凝胶层析葡聚糖凝胶排阻层析是依据分离物分子量大小进行分离的技术,洗脱物的分子量越大最先被洗脱出来,分子小的后被洗脱出来。由图1可知,三斑海马水提物通过Sephadex G-10凝胶分离得到6个峰,分别为FrⅠ、FrⅡ、FrⅢ、FrⅣ、FrⅤ、FrⅥ。

图1　Sephadex G-10凝胶过滤层析分离洗脱曲线Fig.1　Elution profile of Gel filtration chromatography of Sephadex G-10

2.1.2三斑海马水提物Sephadex G-10凝胶层析酚类及氨基酸的分布收集Sephadex G-10凝胶过滤层析馏分3 mL/管,每管取1 mL进行总酚含量和总氨基酸含量测定。以管数为横坐标X,总酚含量为纵坐标Y1,总氨基酸含量为纵坐标Y2,绘制双纵坐标曲线。福林酚法已被广泛用于测定混合体系中总酚含量,然而该方法有一些不足之处,福临酚试剂在碱性条件下也与一些非酚类还原化合物比如氨基酸等反应。

图2　Sephadex G-10凝胶层析总酚及总氨基酸分布Fig.2　Distribution of total phenolics and total amino acid of Sephadex G-10 gel chromatography

2.2各组分成分测定

表1　各组分的总酚含量及总氨基酸含量Table 1　Total phenolics content and the total amino acid content of each fraction

FrⅠ～FrⅣ均含有酚类化合物,其含量有差异,其中FrⅥ总酚含量最高为(298.38±5.78) mg EGCG/g组分,而其分子量也是最小。组分中FrⅠ、FrⅡ、FrⅣ检测到氨基酸或小分子肽,其中FrⅡ的含量最高为(128.938±0.252) mg Gly/g组分。

2.3抗氧化活性

2.3.1DPPH·清除力DPPH自由基由于苯环的共轭和位阻及硝基的电子作用,是一种稳定的自由基,其在乙醇溶液呈紫色,当DPPH溶液中加入自由基清除剂时,DPPH自由基的单电子被配对而使其紫色变浅,A517nm值变小,而吸光值变小的程度与自由基被清除的程度呈剂量依赖的线性关系[14],因此用来检测自由基清除情况,本实验将DPPH自由基清除能力作为评价抗氧化能力较强的三斑海马水提物凝胶层析分离组分的初步筛选指标。FrⅣ、FrⅤ和FrⅥ用于进一步的抗氧化活性评价。

表2　各组分DPPH·清除力IC50Table 2　IC50 of DPPH radicals scavenging ability of each fraction

图3　组分的DPPH·清除Fig.3　Free radical scavenging rate of FrⅣ～FrⅥ

DPPH自由基被广泛应用于评价天然产物清除自由基活性的实验中。对于分离组分的DPPH·清除能力实验结果表明,FrⅣ(IC50=0.25 mg/mL)>FrⅥ(IC50=0.58 mg/mL)>FrⅤ(IC50=2.01 mg/mL)。各组分的DPPH·清除能力明显弱于对照组VC,FrⅣ虽与VC的DPPH自由基清除能力相差一个数量级,但与FrⅥ相比具有较高的DPPH·清除能力,其可能与FrⅣ含有小分子肽、游离氨基酸和酚类化合物有关,这些物质可作为供氢体。

2.3.2总还原力还原能力是评价抗氧化能力的一个重要指标,也是抗氧化机理之一。抗氧化剂通过自身的抗氧作用给出电子而清除自由基,还原力越强,抗氧化性越强。在检测浓度范围内,相同浓度下组分的总还原力大小依次为FrⅣ>FrⅥ>FrⅤ。其中FrⅣ浓度为1.0 mg/mL时,接近于浓度为0.2 mg/mL的VC总还原力。对于FrⅥ、FrⅤ,总还原力是与总酚含量相关。对于FrⅣ,其较高的还原力可能与组分中含有的氨基酸、小分子肽相关。

图4　组分的总还原力Fig.4　Total reducing power of FrⅣ～FrⅥ

2.3.3羟基自由基清除力羟基自由基是已知活性最强的活性氧自由基,对照组VC的羟基自由基清除力IC50值为0.41 mg/mL,样品组:FrⅣ(IC50=1.32 mg/mL)>FrⅥ(IC50=1.91 mg/mL)>FrⅤ(IC50=1.95 mg/mL)。分离组分中FrⅣ的具有相对较强的羟基自由基清除能力,当浓度为2.0 mg/mL,清除率达到80%,可能与组分中含有清除活性氧自由基能力较强的游离氨基酸、小分子肽有关。在测定的样品浓度范围内,FrⅥ、FrⅤ的羟基自由基清除能力相平。

图5　组分的羟基自由基清除Fig.5　The hydroxyl free radical scavenging of FrⅣ-FrⅥ

2.3.4铁离子螯合能力实验结果表明,随着样品浓度的增大,各样品的铁离子螯合能力也随之增加。对照组EDTA-2Na的铁离子螯合能力的IC50值为0.074 mg/mL。样品组的铁离子螯合能力:FrⅣ>FrⅥ>FrⅤ,EDTA-2Na铁离子螯合能力IC50<0.10,均显著(p<0.01)高于各个样品组的铁离子螯合能力。

图6　组分的铁离子螯合能力Fig.6　Ferrous ion chelating ability of FrⅣ～FrⅥ

鱼类中存在抗氧化化合物保护它们的脂质和其他含有双键的化合物,用于减少活性氧簇对其引起的损伤,这些化合物含有很多化学基团,通过不同机制发挥抗氧化作用。这些包括氨基酸、肽、抗坏血酸、类胡萝卜素、酚类化合物等[15-17]。三斑海马作为一种不可直接食用的海洋硬骨鱼,水溶性组分富含多酚、氨基酸、小分子肽。本文三斑海马水提取物经葡聚糖凝胶层析柱分离得到的不同组分,评价其基于DPPH·清除、·OH清除、总还原力、Fe3+螯合能力的抗氧化活性。结果表明分离组分中的FrⅣ-Ⅵ具有良好的自由基清除能力,在一定浓度范围内,抗氧化活性和浓度呈剂量依赖关系。

酚类化合物是三斑海马中抗氧化活性较强的成分,其抗氧化活性据研究表明是由于氧化还原性质[18],能够吸收和中和自由基,淬灭单线态氧和三重态氧,或分解过氧化物。杨梅叶水提物的DPPH自由基清除IC50为73.7 μg/mL,其抗氧化活性和高浓度的酚类化合物有关[19]。Rossita Shapawi1等[20]评价了鲍氏海马的不同极性提取物的抗氧化性,表明与总酚含量相关,其酚类化合物的分布和极性相关,其中极性较大的水溶性组分的抗氧化活性也较强。

氨基酸常被认为是具有协同作用的抗氧化剂。它们协同机制可能有以下两个方面解释:通过与促进氧化的微量金属螯合或使已被氧化的抗氧化剂得以再生。已经表明了氨基酸作为天然食品中具有协同抗氧化的作用[21]。已经研究表明,氨基酸能和其他抗氧化剂产生共价键,形成比抗氧化剂本身的抗氧化活性更高的合成衍生物。同时,氨基酸本身可以作为抗氧剂,张英等[21]研究19种氨基酸对活性氧自由基的清除能力,表明氨基酸普遍具有生物抗氧化活性。大豆水解物中蛋白肽种类和含量与抗氧化活性存在关系,分子量减小将有助于提高抗氧化活性,游离氨基酸和小分子肽的抗氧化活性比分子量较大的蛋白活性明显提高[23]。分离组分中FrⅣ具有较强的抗氧化活性可能与其组分中含有氨基酸、小分子肽、酚类化合物有关,该组分中的氨基酸可能协同酚类物质产生强有力的抗氧化活性。

三斑海马小分子水提物不同组分的抗氧化活性和氨基酸、小分子肽、酚类化合物有关,且和含量、类型有关。FrⅣ相对FrⅠ、FrⅡ的总氨基酸差异不显著(p>0.05),但是含有较高含量的总酚,其DPPH·清除能力较强,表明和总酚含量相关。FrⅤ、FrⅥ中不含有氨基酸,FrⅤ、FrⅥ的差异在总酚含量和酚类化合物分子量,FrⅥ具有较高含量的总酚,其抗氧化活性强于FrⅤ的。FrⅣ具有较好的DPPH·清除力、·OH清除力、总还原力、铁离子螯合率,表明其组分中的总酚、氨基酸、小分子肽具有良好的抗氧化活性,或者其表现出的抗氧化活性是氨基酸与其他抗氧化剂协同作用的结果。

3　结论

本文对三斑海马水提物的抗氧化活性进行探讨,初步证实了三斑海马小分子水提物具有抗氧化活性,抗氧化活性与组分的酚类、氨基酸含量与种类关系密切。具体氨基酸以及酚类物质的组成有待进一步分析,氨基酸是否协同其他抗氧化剂促进抗氧化活性有待进一步论证。

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Antioxidant activity of aqueous extract from Three-spot hippocampus

CHEN Li-ping1,SHEN Xuan-ri1,*,CHEN Guo-hua2,SUN Fei-fei1,JIN Mei-na1

(1.College of Food Science and Technology,Hainan University,Haikou 570228,China;2.College of Ocean,Hainan University,Haikou 570228,China)

The antioxidant capacity of aqueous soluble extract with small molecules of Three-spot hippocampus was investigated. Three-spot seahorse was taken as raw material,extracts were obtained via reflux extraction using 95% ethanol and systematic solvent extraction. Aqueous extract was selected for further analysis amongst the resulted various polar extracts. Six fractions were obtained by eluting through Sephadex G-10 gel filtration chromatography. Anti-oxidative activities of DPPH free radical scavenging,and hydroxyl radical scavenging,total reducing power and ferrous ion chelating ability were determined and evaluated at multiple concentrations and total polyphenols and total amino acids of varying fractions. The results indicated:by contrast,DPPH free radical clearance of FrⅣ was the highest with the of IC50of 0.25 mg/mL. Total reducing power FrⅣ was potent,FrⅣ exhibited the highest capacity for scavenging hydroxyl radical and ferrous ion chelating ability. Collectively,the antioxidant activity of aqueous soluble extract with small molecules of Three-spot hippocampus seemed to have correlation with the distinct contents and types of phenolic compounds,amino acids,small molecular peptides.

Three-spot hippocampus;aqueous extract;antioxidant activity

2015-06-23

陈莉萍(1987-),女,硕士研究生,研究方向:水产品精深加工,E-mail:705285070@qq.com。

申铉日(1968-),男,博士,教授,研究方向:海洋生物资源利用、食品科学,E-mail:shenxuanri2009@163.com。

十二五国家科技支撑计划课题(2013BAB01B04)。

TS201.2

A

1002-0306(2016)03-0114-05

10.13386/j.issn1002-0306.2016.03.015