利用微藻提取类胡萝卜素方法研究进展

许颖颖,王晚晴,2,华　威,2,刘文慧,2,田朝玉,程艳玲,2，*

(1.北京联合大学生物化学工程学院,北京 100023;2.生物质废弃物资源化利用北京市重点实验室,北京100023)



利用微藻提取类胡萝卜素方法研究进展

许颖颖1,王晚晴1,2,华威1,2,刘文慧1,2,田朝玉1,程艳玲1,2，*

(1.北京联合大学生物化学工程学院,北京 100023;2.生物质废弃物资源化利用北京市重点实验室,北京100023)

近年来,人工合成类胡萝卜素的生物学效应和安全性备受质疑,微藻作为天然类胡萝卜素的最佳来源受到人们广泛的关注。在由微藻生产类胡萝卜素的过程中,提取技术是影响其推广应用的关键环节之一。本文首先介绍常见的高产类胡萝卜素微藻藻种,然后综述了目前国内外关于微藻类胡萝卜素的各种提取方法以及最新研究进展,对其中能够实现微藻培养和类胡萝卜素提取同时进行的原位萃取法进行重点阐述。最后对微藻类胡萝卜素的未来发展方向提出建议。

微藻,类胡萝卜素,提取方法

类胡萝卜素是一类脂溶性的类异戊二烯化合物,广泛存在于各种植物、动物和微生物中,作为生物体内的天然抗氧化剂,发挥重要的生理功能。有研究表明,类胡萝卜素具有预防和治疗人类疾病以及改善人体健康状况的功效,如预防心血管疾病,治疗癌症,改善视力,增强人体免疫力等。近年来,类胡萝卜素在医药、食品、保健品、化妆品以及饲料行业中得到了广泛的应用,其全球市场需求量以每年2.9%的速度增长,预计2017年可达到1000万t[1]。然而,这些商品化的类胡萝卜素大多源于化学合成,其生物学效应和安全性一直受到人们的质疑[2-3]。随着人们健康意识的不断加强,从天然原料中获得的类胡萝卜素受到越来越多的消费者欢迎。

近年来,微藻作为生产生物燃料的可持续和可再生资源受到越来越多的关注。然而,微藻生物燃料技术不成熟、生产成本过高,至今未获产业化突破。有学者将目光逐渐转移到微藻其它高附加值产物的生产研究中。微藻被认为是具有商业价值的天然类胡萝卜素的最佳来源,从微藻中提取类胡萝卜素具有明显的优势:首先,微藻生长迅速,易培养,适合大规模养殖;其次微藻代谢合成的色素种类很多,如β-胡萝卜素、叶黄素、虾青素等,而且这些色素的生物活性和抗氧化性已被证实;最后,微藻生长不受季节影响,不争耕地和淡水资源,而且微藻适应性强,一些藻种在污水中也可以生长繁殖[4-5]。因此,研究并开发微藻中的类胡萝卜素,既可扩大天然类胡萝卜素来源,又可提高藻种的利用价值,从而带来巨大的经济效益。

然而,就目前的情况来看,过高的生产成本是制约微藻类胡萝卜素商业化生产的首要问题。利用微藻生产类胡萝卜素需要经过微藻的培养、藻体的采收以及提取纯化三个阶段。其中,藻体的采收和类胡萝卜素的提取是决定生产成本高低的关键技术。本文结合国内外已发表的文献对微藻类胡萝卜素的各种提取技术进行总结,旨在为微藻类胡萝卜素的进一步研究开发提供一定的参考。

表1　不同微藻类胡萝卜素种类及含量Table 1　Carotenoid contein in carotenoid-rich microalgae

1　常见的高产类胡萝卜素微藻藻种

对微藻作为类胡萝卜素源的研究始于20世纪60年代,到目前为止所发现的富含类胡萝卜素的微藻主要来自绿藻门,包括:小球藻Chlorella,栅藻Scenedesmus,衣藻Chlamydomonas,杜氏藻Dunaliella,Muriellopsis以及红球藻Haematococcus等。在这些藻种中,杜氏盐生藻Dunaliellasalina和雨声红球藻Haematococcuspluvialis已经用于商业化生产β-胡萝卜素和虾青素。常见产各种类胡萝卜素的藻种及其含量如表1所示。

2　微藻类胡萝卜素提取方法

近年来,如何有效地从微藻原料中提取类胡萝卜素成为各国学者研究和探索的重点内容。从微藻中获得类胡萝卜素通常需要经过如下步骤:藻体收集→干燥处理→细胞破碎→提取操作。然而,藻体收集、干燥、细胞破碎需要消耗大量能量,导致成本偏高。一些学者改进传统的提取方法,将微藻的采收、破壁、提取结合起来或是省去微藻干燥步骤,从而简化操作步骤,减少能量消耗,降低生产成本。目前,常用来提取微藻中类胡萝卜素的方法主要有:有机溶剂提取法、加压溶剂提取法、超临界/亚临界流体萃取法、原位萃取法、双水相萃取法等。

2.1有机溶剂提取法

传统的有机溶剂提取法是目前微藻类胡萝卜素提取常用的方法之一。然而,一些高产类胡萝卜素的藻种,像小球藻Chlorella,栅藻Scenedesmus,Muriellopsis等,它们的细胞壁十分坚硬,破壁困难,常常导致类胡萝卜素提取不完全。因此,在微藻类胡萝卜素提取之前,需要进行细胞破壁操作,或是采用一些辅助提取手段,将微藻细胞破壁过程与提取操作同时进行。Cerón等[15]从栅藻ScenedesmusAlmeriensis中提取叶黄素时,比较5种不同的藻体破壁前处理方法(氧化铝研钵法、球磨法、氧化铝球磨法、超声波破碎法、氧化铝球磨法结合超声破碎法)对栅藻叶黄素提取率的影响。发现细胞破碎处理对叶黄素提取率具有很大的影响,最佳的细胞破碎方法是采用氧化铝球磨法处理5 min,其提取率达到98%,而未破碎的细胞中叶黄素的提取率仅为40%。Deenu等[16]优化了超声辅助90%乙醇提取小球藻粉Chlorellavulgaris中叶黄素工艺条件,在超声功率为35 kHz、超声强度56.58 W/cm2、提取温度37.7 ℃、提取时间5 h,固液比31 mL/g最优条件下,提取的叶黄素含量为(3.16±0.03)mg/g。赵晓燕等[17]对变频微波辅助有机溶剂(乙酸乙酯∶乙醇=1∶2;v/v)提取雨生红球藻Haematococcuspluvialis中的虾青素提取条件进行优化,最佳液料比、提取温度、提取时间分别为200∶1、45 ℃、20 min,虾青素提取率为36.88%,该研究显示变频微波辅助混合有机溶剂萃取可快速提高雨生红球藻中虾青素提取率。表2总结了微藻破壁常用的几种方法的原理及优缺点。

表2　微藻细胞不同破壁方法比较[18-19]Table 2　Comparison of different methods for breaking microalgae cells[18-19]

微藻中的类胡萝卜素主要以游离和脂肪酸酯两种形式存在[20]。而采用有机溶剂提取出的类胡萝卜素往往还存在叶绿素、油脂等杂质。这些物质的存在会影响提取出的类胡萝卜素的纯度,对后续操作产生影响。对类胡萝卜素样品进行皂化处理,不仅可以将结合态的类胡萝卜素释放出来,提高游离态类胡萝卜素含量,而且能够有效去除叶绿素、油脂等杂质,从而使提取的类胡萝卜素样品纯度更高[21]。皂化试剂一般选用KOH的甲醇溶液或水溶液,可以在室温下皂化,也可以对样品进行适当加热处理,缩短皂化时间;皂化结束后用正己烷或石油醚等极性偏小的有机溶剂进行萃取;最后萃取产物再经水洗去除KOH。但皂化会对类胡萝卜素产生破坏,降低类胡萝卜素的提取量,因此应严格控制皂化条件,尽可能避免皂化带来的损失。Cerón等[15]提出了一种适合工业化生产栅藻ScenedesmusAlmeriensis叶黄素的提取工艺,并对提取条件进行优化。这种方法主要包括三个步骤:细胞破碎,碱处理,溶剂提取。优化结果表明,先采用氧化铝球磨法处理藻粉5 min,再用4% w/v KOH溶液处理100 g/L藻体5 min,最后用与样品相同体积的正己烷萃取,萃取次数为6次，叶黄素的回收率可达95%。

如果采用传统的提取方法,在提取微藻类胡萝卜素之前,需要进行采收和干燥等步骤,从而使生产成本增加。Kang等[22]采用一种新的溶剂提取方法从雨生红球藻Haematococcuspluvialis中提取游离的虾青素。该方法共分为2个阶段,在第一阶段他们用十二烷从雨生红球藻培养液中提取虾青素及虾青素酯,然后将十二烷与含有细胞碎片的培养基分离;第二阶段是将十二烷与相同体积的0.02 mol/L NaOH-甲醇溶液不断混合,在此过程中十二烷相中的虾青素及其酯不断转移到甲醇相中,虾青素酯在甲醇相中通过皂化反应转变成游离的虾青素,最后通过分离操作将两相分开,十二烷相可以继续循环使用。两个阶段虾青素的提取率分别在95%和85%以上。与其他提取方法相比,该法可以省去微藻采收环节,操作简单,低能耗,具有很高的开发应用价值。然而由于有机溶剂具有一定的挥发性和毒性不利于人体健康和环保,因此,可以采用绿色溶剂植物油取代传统的有机溶剂提取微藻中的类胡萝卜素。Kang等[23]使用常见的几种植物油(大豆油、玉米油、葡萄籽油、橄榄油)提取雨生红球藻中的虾青素。在常温下,取相同体积的植物油与雨生红球藻培养液混合,强力搅拌使藻细胞破碎,静置使两相分层,植物油将藻细胞中的虾青素萃取出来,藻细胞留于下相,油相的回收率可达到88%以上。该法绿色环保,能够有效地保持油脂的稳定性和天然性。提取完毕后,可以采用吸附的方法将微藻类胡萝卜素与植物油分离。Baharin[24]采用两种大孔吸附树脂吸附棕榈油中的类胡萝卜素,吸附完毕后将吸附剂与棕榈油分离,最后使用索氏提取法使吸附剂上的类胡萝卜素解吸附。

2.2加压溶剂萃取法

加压溶剂萃取(pressurized liquid extraction,PLE),也称加速溶剂萃取(Accelerated Solvent Extraction,ASE)是一种新型的样品前处理技术,目前已在农业、食品、环境、医药等领域有着广泛的应用[25]。其原理是在温度(50～200 ℃)及高压(500～3000 psi)的条件下,物质的溶解度和溶质的扩散效率会相应提高,从而达到增加提取率的目的[26]。与其他提取法相比,PLE具有萃取时间短、溶剂用量少、提取效率高、自动化程度高等优点。Castro-puyana等[27]采用PLE法从富油新绿藻Neochlorisoleoabundans中提取类胡萝卜素,同时比较PLE法与传统有机溶剂法对类胡萝卜素提取率的高低。结果发现,采用100%乙醇在100 ℃提取20 min的条件下类胡萝卜素的提取率为32.6%,远高于采用含有0.1%(w/v)二丁基羟基甲苯的丙酮提取,其提取率仅为28.3%。

尽管PLE法能够获得较高的类胡萝卜素提取率,然而Grima等[14]学者认为,由于该方法需要较高的提取温度,而高温会使微藻样品中的叶绿素变成具有毒性的脱镁叶绿酸,同时提取的类胡萝卜素的活性也会受到影响,因此采用PLE法萃取微藻中的类胡萝卜素存在一定的缺陷。Jaime等[28]利用PLE法从雨生红球藻Haematococcuspluvialis中提取类胡萝卜素,并对不同温度(50,100,150,200 ℃)下提取的类胡萝卜素的抗氧化活性加以比较。结果表明,在100%乙醇提取20 min的条件下,温度越高,类胡萝卜素提取率越高,而提取物的抗氧化活性随之降低。

然而,Cha等[29]比较PLE法与传统溶剂浸提法、索氏提取法、超声辅助提取法对小球藻Chlorellavulgaris中类胡萝卜素、叶绿素a和叶绿素b以及叶绿素衍生物脱镁叶绿素a和脱镁叶绿酸a含量的影响。他们发现与其它提取方法相比,PLE法显示出对类胡萝卜素和叶绿素更好的提取效果;同时还发现,采用PLE法当提取温度160 ℃时,提取物中的脱镁叶绿酸a含量最小,仅为(0.01±0.00)mg/g,而传统溶剂浸提法、索氏提取法、超声辅助提取法脱镁叶绿酸a的含量分别为0.85±0.09、5.15±0.59、(2.15±0.71)mg/g。他们推测这是由于高温(>110 ℃)会使叶绿素酶失活,而其他提取方法是在温度为20～80 ℃较温和的条件下操作,叶绿素酶具有活性,加速了叶绿素转变为脱镁叶绿酸。因此,采用PLE法提取微藻中的色素是非常有前景的提取技术。

2.3超临界/亚临界流体萃取法

超临界流体萃取法(Supercritical fluid extraction,SFE)是一项环境友好型绿色提取技术,是以超临界流体为溶剂,从待提物中萃取可溶性组分的分离操作。由于超临界流体具有低粘度和良好的扩散性能,使得提取效率更快速有效。通过改变超临界流体的密度可以有选择的提取微藻中的活性成分,提取完毕后,通过升高温度或降低压力,使超临界流体变成普通气体逸出,提取出的类胡萝卜素无溶剂残留,提取后的藻粉也可进一步利用。超临界流体具有非燃性、无毒、化学性质稳定等优点,因此生产的产品安全性更高。

Kitada等[30]采用超临界CO2萃取小球藻Chlorellavulgaris中的类胡萝卜素和叶绿素,研究了提取压力、温度、夹带剂(乙醇和丙酮)对提取物中色素含量的影响,并与传统的索氏提取法进行比较。研究发现,最佳的提取压力和温度为50 MPa和80 ℃;超临界CO2萃取法可以有选择性的萃取叶黄素,但提取率低,而加入7.5%的乙醇作为夹带剂可以有效的提高提取物中叶黄素的含量,但同时也提高了叶绿素的含量,导致提取的叶黄素纯度较低;与SFE法相比,索氏提取法对色素的提取率最高。对此,有学者提出一种更有效的解决办法。Bing等[31]采用超临界流体抗溶剂法(Supercritical fluids extraction anti-solvent)从微绿球藻Nannochloropsisoculata索氏提取法的粗提物中提取纯化玉米黄素。结果显示,玉米黄素的纯度为93.8%。该方法既具有传统有机溶剂提取法和SFE法的优势,同时又有效的避免了有机溶剂的毒性、提取物纯度低等缺点,因此在微藻类胡萝卜素领域具有很大的发展空间。

亚临界流体萃取法(Sub-critical fluid extraction)是利用亚临界流体作为萃取剂,通过分子扩散过程将萃取物料中的脂溶性成分转移到液态萃取剂中,再通过减压蒸发过程使萃取剂与目标产物分离的一种新型萃取技术。亚临界流体是一种处于超临界状态边缘的流体,其压力超过临界点压力,温度低于临界值,是一种高压液体。与超临界流体相比,亚临界流体所需温度更低,接近常温,无需加热设备,在设备投资和能源消耗上更经济可行。并且相同压力的亚临界CO2比超临界CO2密度更高,溶解能力更强。目前,利用亚临界流体萃取法从微藻中提取类胡萝卜素的研究较少,只有黄星歆等[32]做过相关研究。他们采用超声强化亚临界CO2技术提取小球藻中的叶黄素,并对最佳工艺条件进行探究,最后确定最佳工艺条件为:萃取温度25 ℃,萃取压力11 MPa,流体流量30 kg/h,夹带剂无水乙醇用量1.5 mL/g,萃取时间3 h,超声功率750 W,在此条件下,提取的叶黄素含量为68.85 mg/100 g小球藻粉。

2.4原位萃取法

原位萃取法(In situ extraction)是指将藻液与具有生物相容性的有机溶剂不断混合,将类胡萝卜素不断萃取至有机溶剂相,同时微藻细胞仍然不断合成类胡萝卜素,实现微藻培养与类胡萝卜素提取同时进行,从而省去微藻采收环节,提高类胡萝卜素产量,降低生产成本的目的。

Hejazi等[33]将原位萃取法应用于杜氏盐生藻Dunaliellasalinaβ-胡萝卜素的生产中。盐藻细胞在正常条件下培养后,转移到如图1所示的生物反应器中,强光照射诱导其产生大量的β-胡萝卜素,同时不断地向藻液底部注入十二烷,十二烷通过水相的过程将藻细胞中的β-胡萝卜素萃取出来,最后十二烷在泵的作用下从上相重新回到底部继续循环。实验证明:在强光照射和十二烷的存在下,杜氏藻仍然能够存活(>47 d),然而细胞生长变得缓慢,β-胡萝卜素的提取率大于55%。Kleinegris等[34]对原位萃取法应用于盐藻的作用机制进行研究。他们发现:盐藻细胞与水-有机相界面的接触导致细胞死亡,细胞死亡和随后的细胞破裂导致类胡萝卜素的释放使提取过程能够有效的进行。

原位萃取法虽然可以省去传统提取法繁琐的操作步骤,然而,Kleinegris等[35]研究发现采用原位萃取法提取杜氏藻β-胡萝卜素的体积产量较低,为8.3 mg/L-1·d-1,而传统的提取方法产量为13.5 mg/L-1·d-1。此外,两相溶剂的乳化现象以及生物反应器中氧气的不断积累会抑制盐藻的生长,强光照射会使β-胡萝卜素降解。这些缺点都阻碍了原位萃取法的进一步发展。

图1　原位萃取装置示意图Fig.1　Schematic overview of sparged set-up注:图中1代表培养基和十二烷两相,2代表十二烷相, 3代表培养基,4代表齿轮泵, 5代表十二烷气泡,6代表磁力搅拌器。

2.5双水相萃取法

双水相萃取(Aqueous two-phase extraction,ATPE)起始于20世纪60年代,是一项非常具有研发前景的固液分离技术。与一般的水-有机物萃取原理相似,利用样品在两相系统间分配行为的差异进行分离。ATPE系统在生物活性物质提取和分离方面具有广泛的应用前景。目前,用ATPE法提取类胡萝卜素的研究较少,只有Cisneros等[36]做过相关的研究,他们采用采收后的小球藻Chlorellaprotothecoides来研究叶黄素在PEG-磷酸盐双水相系统中的分配行为,首先采用小球藻湿重30%的乙醇提取藻泥中的叶黄素,然后用22.9%(w/w)PEG 8000和10.3%(w/w)磷酸盐在pH7.0组成的双水相系统萃取粗提物中的叶黄素,结果显示绝大部分叶黄素分布于上相,藻细胞碎片分布于下相,叶黄素的产率在81.0%±2.8%。该方法的应用为微藻类胡萝卜素提取方法的研究开发提供了更广阔的思路。

3　展望

微藻中类胡萝卜素含量高、种类丰富而且微藻具有培养周期短、培养条件易控制、可连续生产等优点成为良好的类胡萝卜素来源。然而,利用微藻制备类胡萝卜素却是一个高成本的投入过程,严重制约了微藻类胡萝卜素产品的研究开发。目前,微藻中类胡萝卜素的提取主要采用机械破壁结合有机溶剂法,该法操作简单,容易实现工业化生产,但需要消耗大量的能量和有机溶剂。近年来伴随着一些新的提取技术的研究,正如上文所提到的超声提取法、微波提取法、加速溶剂提取法等都能够在不同程度上有效地提高类胡萝卜素的提取率,缩短提取时间以及减少溶剂消耗。但他们在操作过程中都不可避免的使用有机溶剂,不利于环保。而超临界/亚临界流体萃取法符合“绿色化学”所倡导的理念,生产的类胡萝卜素产品安全性高,但该法对设备要求较高,类胡萝卜素的提取率要低于溶剂法。上述的这些方法均需要对藻体进行采收,这无疑增加了生产成本,而原位萃取法则可以有效地避免采收过程,能够实现微藻培养与类胡萝卜素提取的同步进行,从而减少能源消耗,降低生产成本,但该方法还处于发展阶段,存在提取率低等问题。综上所述,尽管人们对微藻类胡萝卜素的提取已做出了广泛深入的研究,也取得了一定的进展,但目前还没有一种方法可以同时具有高提取率、通用、快速、环保、低成本等优点。

因此,为了提高类胡萝卜素产量,降低生产成本,将来对微藻类胡萝卜素的开发应主要集中在以下几个方面:一是筛选生长快速、类胡萝卜素含量高的经济藻种;二是采用合适的提取方法,简化提取步骤,优化提取工艺,降低生产成本,在不断改进现有方法缺陷的基础上,研究开发新的技术,实现微藻类胡萝卜素的产业化生产;三是利用现代基因工程技术,对微藻藻株进行改造,推进微藻类胡萝卜素的工业化生产进程。相信随着各类新型藻种的开发以及微藻类胡萝卜素提取工艺的不断完善,微藻类胡萝卜素大规模的商业化生产并不遥远。

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Research advances in utilization of microalgae for carotenoids production

XU Ying-ying1,WANG Wan-qing1,2,HUA Wei1,2,LIU Wen-hui1,2,TIAN Chao-yu1,CHENG Yan-ling1,2,*

(1.Biochemical Engineering College,Beijing Union University,Beijing 100023,China;2.Beijing Key Laboratory of Biomass Waste Resource Utilization,Beijing 100023,China)

In recent years,the biological effects and safety of synthetic carotenoids have been disputed. People’s attention has been attracted by microalgae,the best resource of natural carotenoids. In the process of utilizing microalgae for carotenoids production,extracting technology becomes one of the key steps in promotion and application of microalgae carotenoids. In this paper,microalgae specises which have high content carotenoids were introduced,and different extracting methods on carotenoids from microalgae and the latest research progress in China and abroad were reviewed. The in situ extraction in which cultivating microalgae and extracting carotenoids could be carried out simultaneously was particularly discussed. Finally,the future trends of microalgae carotenoids was proposed.

microalgae;carotenoids;extraction

2015-05-13

许颖颖(1990-)，女，硕士研究生，研究方向：生物活性物质分离技术，E-mail:15101632931@163.com。

程艳玲(1972-)，女，博士，副教授，研究方向：生物活性物质分离与生物能源，E-mail:cheng1012cn@aliyun.com。

北京市教委及北京市自然基金重点项目(KZ201411417038)；“863计划”课题(2014AA022002)；国家国际科技合作课题(2014DFA61040) ；北京市科委项目(Z141109004414002，Z121100001312010)。

TS201.1

A

1002-0306(2016)03-0375-07

10.13386/j.issn1002-0306.2016.03.070