豆豉对小鼠吸收镉的影响及其相关机制的初步探究

王登远,裘　梁,魏　华,徐　锋,武晓丽,*

(1.南昌大学中德联合研究院,江西南昌 330047;2.江西中医大学基础医学部,江西南昌 330004)



豆豉对小鼠吸收镉的影响及其相关机制的初步探究

王登远1,裘梁2,魏华1,徐锋1,武晓丽2,*

(1.南昌大学中德联合研究院,江西南昌 330047;2.江西中医大学基础医学部,江西南昌 330004)

为评价豆豉对小鼠吸收镉的影响,本文进行了豆豉在体外吸附重金属和动物实验。结果表明,从豆豉中分离得到6株细菌和2株真菌,这些微生物及其代谢产物可能导致豆豉在体外对镉的吸附率达到78.67%。豆豉组小鼠粪便中镉的含量显著低于对照组,这表明豆豉促进了小鼠对镉的吸收,从而增加了镉在肝脏中的积累。本研究为豆豉的合理食用提供科学的依据。

豆豉,微生物,代谢产物,镉,吸附作用

豆豉起源于我国先秦时代,是以黑豆、黄豆为原料,利用多种微生物共同作用制成的一种传统发酵食品[1]。豆豉在制曲及后发酵过程中,主要有细菌和霉菌等微生物的参与。豆豉在发酵的过程中形成了许多生理活性物质如大豆皂甙、褐色色素、溶栓酶、抗菌素等[2]。因此,豆豉具有抗氧化、降血糖、降血压、抗老年痴呆等多种生理活性功能[3]。

微生物的细胞壁及其分泌的胞外聚合物上存在着大量阴离子基团(羧基、羟基及氨基等),这些官能团可以通过物理吸附、表面络合和离子交换等方式对重金属有吸附作用[4-5]。豆豉由多种微生物参于发酵,并且产生了许多新的代谢产物,形成了其独特的风味和口感。故推测豆豉可能对重金属有吸附作用,因而可能具有危害人体的潜能。然而,目前对于豆豉的研究主要集中在生理活性物质及其营养和药用功能的分析方面,关于豆豉对于重金属吸附及对小鼠吸收重金属的影响的相关性研究仍未有报导。中国很多省份,如江西、江苏、福建、广西等都是重金属污染严重地区,镉大米事件时有发生,并且这些地区都有食用豆豉的习惯,因此,本文以镉为例,进行了相关性的研究。首先对豆豉中的微生物进行分离和鉴定。然后让豆豉与重金属共孵育来评价豆豉在体外对重金属的吸附能力。最后给小鼠灌胃豆豉和氯化镉来研究豆豉在体内对小鼠吸收镉的影响。

1　材料与方法

1.1材料与仪器

豆豉南昌稻香园调味食品有限公司;黑豆为市售;氯化镉国药集团化学试剂有限公司;浓硝酸、高氯酸中国天津永大公司;琼脂、MRS培养基北京索莱宝科技有限公司;LB培养基、土豆培养基青岛高科园海博生物技术有限公司;BALB/c小鼠30只(18～20 g,雌性)江西省南昌大学动物科学部门。

高温蒸汽压力灭菌锅中国上海博讯实业有限公司;镉空心阴极灯上海光谱仪器有限公司;SP-3520AA型原子吸收分光光度仪上海光谱仪器有限公司;恒温培养箱上海智城分析仪器制造有限公司;YQX-II型厌氧培养箱上海跃进医疗器械厂。

1.2实验方法

1.2.1豆豉中的细菌和真菌的分离与纯化在无菌条件下,将豆豉研磨成粉末,然后取1 g样品溶于9 mL无菌PBS(0.01 mol/L)中,用漩涡振荡器振荡10 min后,将样品进行10倍逐级梯度稀释。分别取稀释梯度为10-3、10-4、10-5、10-6的稀释液各100 μL分别涂布于LB平板、MRS平板和土豆培养基平板上[6]。LB平板在37 ℃、有氧条件下培养24 h;MRS平板在37 ℃、厌氧条件下培养48 h;土豆培养基在25 ℃、有氧条件下培养72 h。然后用接种环将平板上菌体形态、特征不同的菌落进行划线分离。平板纯化6次后用30%的甘油保菌,于-80 ℃冰箱中保藏。

1.2.2细菌的鉴定将分离纯化得到的细菌进行液体扩大培养,然后提取各个单菌落的基因组DNA。以细菌的基因组DNA为模板,采用细菌16S通用引物F:5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′;R:5′-GGCTACCTTGTTACGACTT-3′进行PCR扩增[7]。将扩增产物送至上海生工生物工程有限公司测序,测序结果通过NCBI的检索程序进行同源性分析。

1.2.3真菌的鉴定将分离纯化得到的真菌进行液体扩大培养,然后提取各个单菌落的基因组DNA。以真菌的基因组DNA为模板,采用真菌通用引物F:5′-GTAGTCATATGCTTGTCTC-3′;R:5′-ATCCA TTCAATCGGTATT-3′进行PCR扩增[7]。将扩增产物送至上海生工生物工程有限公司测序,测序结果通过NCBI的检索程序进行同源性分析。

1.2.4豆豉在体外对镉的吸附作用在无菌条件下,将豆豉、黑豆(已灭菌)研磨成粉末。用无菌的PBS(0.01 mol/L)配成浓度为0.01 mmol/L的氯化镉溶液。按10%(w/v)比例将豆豉和黑豆分别加入氯化镉溶液中,置于37 ℃,孵育2 h。孵育2 h后,将样品在常温、10000 r/min的条件下,离心5 min,取上清。最后分别测定上清中镉的含量[8]。计算吸附率Q。

Q(%)=(C0-C)/C0×100

式中:C0:氯化镉溶液中镉的浓度;C:经过孵育后,上清中镉的浓度。

1.2.5豆豉在体外对铜的吸附作用在无菌条件下,将豆豉、黑豆(已灭菌)研磨成粉末。用无菌的PBS(0.01 mol/L)配成浓度为0.01 mmol/L的氯化铜溶液。按10%(w/v)比例将豆豉和黑豆分别加入氯化铜溶液中,置于37 ℃,孵育2 h。孵育2 h后,将样品在常温、10000 r/min的条件下,离心5 min,取上清。最后分别测定上清中铜的含量[8]。计算吸附率Q。

Q(%)=(C0-C)/C0×100

式中:C0:氯化铜溶液中铜的浓度;C:经过孵育后,上清中铜的浓度。

1.2.6小鼠的饲养和处理从南昌大学动物科学部购买30只健康活泼的BALB/c小鼠(18～20 g)。然后将小鼠在恒温25 ℃,湿度55%～65%,空气清新的饲养房平衡一周后随机分为3组,分笼饲养(6只/笼)[9]。小鼠在饲养过程中自由采食、饮水。在无菌条件下,将豆豉、黑豆(已灭菌)研磨成粉末。用无菌的PBS(0.01 mol/L)配成浓度为2 mmol/L的氯化镉溶液。按10%(w/v)比例将豆豉和黑豆分别加入氯化镉溶液中,最后分别按照100 μL/只灌胃小鼠[10],对照组只灌胃氯化镉。每天灌胃一次,连续灌胃7 d。每天收集各实验组小鼠的粪便一次,共8次。

1.2.7小鼠各种器官的收集及样品的消解于第7 d灌胃结束后,所有小鼠禁食过夜,次日摘眼球取血。将小鼠采用颈椎脱臼法处死后,分别取出肝、肾和脾脏放入-20 ℃冰箱中保存备用。

将小鼠的粪便、血液、肝、肾和脾等器官从-20 ℃取出,充分解冻。分别称取小鼠的器官0.5 g置于预先贴好标签的50 mL烧杯中。先向烧杯中加入10 mL HNO3,摇床上摇匀几分钟后,再加入2 mL HClO4。摇床上摇匀后将烧杯放置在电热板上,先小火加热均匀,待试样完全溶解后将电热板的温度调高至260 ℃。加热消解至消化液成无色透明或略带黄色的一层薄薄的晶体状后取下消解好的试样[11]。待冷却后,向烧杯中加入适量的超纯水,摇匀后移至10 mL容量瓶中。最后,用超纯水清洗烧杯3次以上,将清洗液合并至容量瓶中,然后用超纯水定容至刻度,混匀,待测。同时做试剂空白实验。

1.2.8测定条件选择及标准曲线原子吸收光谱仪的工作条件:波长228.8 nm;灯电流3 mA;燃烧头高度10 mm;空气流量5.5 L/min;乙炔流量1.0 L/min;狭缝宽度0.2 nm。

首先配制成系列标准溶液,最后以吸光度对质量浓度进行回归。镉标准溶液质量浓度为0.00、0.03、0.10、0.60、1.50、2.40、3.00 mg/L,标准曲线A=0.1795C+0.0073,r=0.99743。铜标准溶液质量浓度为0.00、0.05、0.10、1.50、2.50、3.00、4.00 mg/L,标准曲线A=0.1986C+0.0087,r=0.99867。

1.2.9数据处理采用spss13.0进行数据处理分析,计量数据以mean±SD表示,采用单因素方差分析比较组间差别,p<0.05表示具有显著性差异,p<0.01表示具有极显著性差异。

2　结果与讨论

2.1豆豉中细菌的分离和鉴定

通过对菌落形态及菌体特征分类后可知,从豆豉中一共分离出6株细菌。

表1　豆豉中主要细菌鉴定的结果Table 1　The identification results of the main bacteria in Douchi

不同菌体形态、特征的单菌落鉴定的结果显示从豆豉中分离纯化得到的细菌主要为枯草芽孢杆菌、乳酸片球菌、发酵乳杆菌等6种菌株。

枯草芽孢杆菌可产生枯草菌素、多粘菌素、制霉菌素和短杆菌肽等活性物质,这些活性物质对某些有害致病菌有明显的抑制作用。并且枯草芽孢杆菌的一些菌株是α-淀粉酶和中性蛋白酶的重要生产菌。枯草芽孢杆菌为豆豉发酵期间的主要菌群,对豆豉的各种品质以及功能性成分起到重要的作用[12]。

魏斯氏菌、乳酸片球菌、戊糖片球菌和发酵乳杆菌均属于乳酸菌。乳酸菌是发酵糖类产生大量乳酸的细菌的总称,乳酸菌在发酵食品加工过程中可产生胞外多糖、乳酸菌素、乳酸和H2O2等多种代谢物。乳酸菌在豆豉生产过程中对良好风味的形成也起着非常重要的作用[13]。

葡萄球菌属是一群革兰氏阳性球菌,多数为安全菌株,少数可导致疾病。董素琴等人也从豆豉中分离出葡萄球菌属[14],于立权等人的研究表明葡萄球菌属中某些菌株的胞外分泌物中含有多种酶类[15]。

2.2豆豉中真菌的分离和鉴定

根据不同菌丝体的形态颜色等特征进行分离并鉴定之后可知,伞枝犁头霉和米曲霉为豆豉中优势的真菌。

表2　豆豉中主要真菌鉴定的结果Table 2　The identification results of the main fungus in Douchi

作为发酵工业中重要的生产用菌,霉菌可以生产抗生素、酶制剂等许多重要的发酵产品。

霉菌所产生的蛋白酶、淀粉酶等复合酶一直作用于豆豉发酵过程中,这些复合酶对豆豉发酵过程中所产生的风味和营养具有重要作用[16]。

2.3豆豉在体外对重金属的吸附作用

由表3可知,豆豉和黑豆(已灭菌)分别与重金属共孵育2 h后,豆豉对镉的吸附率达到78.67%,而黑豆(已灭菌)对镉的吸附率小于0.1%;豆豉对铜的吸附率达到71.63%,而黑豆(已灭菌)对铜的吸附率小于0.1%。

表3　豆豉在体外对重金属的吸附作用Table 3　The adsorption of Douchi for heavy metal in vitro

注:表中**表示豆豉组与黑豆组比较具有极显著性差异,p<0.01。

目前,许多文献已报道微生物可通过细胞壁多糖以及胞外聚合物中的羧基、羟基和氨基等官能团对镉有明显的吸附作用,比如代淑娟等的研究表明枯草芽孢杆菌对电镀废水中镉有明显的吸附作用[17];王远红等结果表明利用微生物的胞外聚合物去除环境水样中的镉是可行的[8];姜烛等研究说明霉菌可以很好的去除水体镉离子[18]。许多文献已报道豆豉在制曲及发酵过程中,有许多霉菌、细菌等微生物的参与[19]。故推测豆豉和黑豆对重金属吸附作用的差异可能是由豆豉中的微生物引起的,即豆豉中的微生物以及微生物分泌的代谢产物在豆豉吸附重金属中起到关键的作用。

2.4小鼠粪便中镉含量的变化

由图1可知,从第0 d到第3 d,各实验组的小鼠粪便中镉的含量随着时间的变化逐渐增大,到第4 d后趋于稳定。黑豆组小鼠粪便中镉的含量与对照组相比无显著差异(p>0.05)。因此,黑豆在小鼠体内对镉的吸收无影响。

图1　小鼠粪便中镉的含量Fig.1　The content of cadmium in the feces of mice注:*表示豆豉组与对照组相比有显著差异,p<0.05; **表示豆豉组与对照组相比有极显著差异,p<0.01。

和对照组相比,豆豉组小鼠粪便中镉的含量从灌胃第2 d后就开始显著降低。推测该变化可能是因为豆豉中的微生物以及分泌的代谢产物对镉有吸附的作用,然后被吸附的镉富集在小肠细胞的表面进而被吸收到小鼠体内,最终导致排出体外的镉含量降低。然而具体是哪几株发酵菌株,单独或者协同发挥这种作用,还需要我们进一步研究。

2.5小鼠各种器官中镉含量的变化

由图2可知,在该灌胃剂量下,肝脏和肾脏中的镉的含量比较高,其中肝脏中镉的含量最高。然而,脾脏和血液中镉的含量却接近于0。这个原因可能是镉主要蓄积在肝脏和肾脏中[20]。黑豆组镉的含量与对照组相比无显著变化,这表明作为豆豉的发酵原料,黑豆自身组分并未参于镉的吸收和运转。豆豉组小鼠肝脏中镉的含量和对照组相比显著升高。在本剂量下,未发现镉对小鼠的各种器官有明显的毒害作用。

图2　小鼠各种器官中的镉的含量Fig.2　The content of cadmium in various organs of mice注:图中*表示豆豉组与对照组比较 具有显著性差异,p<0.05。

关颖等人发现肝脏中镉的吸收与受体依赖性钙通道有关[21],徐莉春等人发现金属硫蛋白(MT)对金属的高度亲合力是引起镉在体内蓄积的主要原因[22]。与黑豆组相比可知,豆豉特异性的增加了镉在肝脏中的累积,而并未促进在肾脏的累积,推测这与豆豉发酵过程中的微生物及其新合成出的代谢产物有关,然而豆豉是否选择性的激活了肝细胞的受体依赖性钙通道,导致镉通过钙通道被吸收和蓄积,还是选择性地诱导肝脏中金属硫蛋白(MT)的生物合成,进而引起了镉在肝脏的蓄积,或者还存在其他的作用机制,以及具体是哪些豆豉组分参于了其中的过程,都有待深入研究。

欧阳彩群等人发现小鼠饮用含氯化镉蒸馏水(30 mg/L)2周后,各种器官也未有明显的损害[23]。因此,我们会调整豆豉以及镉的灌胃剂量和周期,来进一步研究豆豉与镉引起的疼痛、消化不良、骨折等病害之间的关联。

3　结论

从豆豉中分离得到的细菌为枯草芽孢杆菌、魏斯氏菌、乳酸片球菌、戊糖片球菌、发酵乳杆菌和葡萄球菌,真菌为伞枝犁头霉和米曲霉。豆豉在体外对镉的吸附率达到78.67%,原因可能是豆豉中的微生物或分泌的代谢产物参与了对镉的吸附作用。豆豉促进了镉被吸收进小鼠的体内,最终增加了镉在肝脏中的积累。因此,被镉污染的地区的人们应该避免食用豆豉。本研究结果将为豆豉的合理食用提供科学依据,也为传统发酵食品的安全性评估提供借鉴。

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Effect of Douchi on the absorption of cadmium in mice and tentative study of related mechanisms

WANG Deng-yuan1,QIU Liang2,WEI Hua1,XU Feng1,WU Xiao-li2,*

(1.Jiangxi-OAI Joint Research Institute,Nanchang University,Nanchang 330047,China;2.Jiangxi University of Traditional Chinese Medicine,Nanchang 330004,China)

To evaluate the effect of Douchi on the absorption of cadmium in mice,the adsorption of Douchi for heavy metalinvitroand animal experiments were carried out. The results showed that six strains of bacteria and two strains fungus were isolated from Douchi. Microbes and metabolites may cause Douchi to have good adsorption efficiency of 78.67% for cadmiuminvitro. The content of cadmium in the feces of mice treated with Douchi was significantly lower than that in the control group. It indicated that Douchi promoted the absorption of cadmium in mice and aggravated the accumulation of cadmium in liver. It provided scientific basis for the reasonable edible of Douchi.

Douchi;microbe;metabolites;cadmium;adsorption

2015-07-13

王登远(1989-)，男，在读研究生，研究方向：食品生物技术，E-mail:872245358@qq.com。

武晓丽(1981-)，女，博士，讲师，研究方向：生物与分子生物学，E-mail:710788651@qq.com。

国家自然科学基金项目(81160494，31260363，31170091)。

TS201.4

A

1002-0306(2016)03-0339-04

10.13386/j.issn1002-0306.2016.03.062