高产γ氨基丁酸乳酸菌菌株的诱变选育与鉴定

双　全,万　月,刘　俐

(内蒙古农业大学食品科学与工程学院,内蒙古呼和浩特 010018)



双全,万月,刘俐

(内蒙古农业大学食品科学与工程学院,内蒙古呼和浩特 010018)

本文以从内蒙古传统发酵食品中分离的80株乳酸菌为研究对象,在GYP培养基中进行高产γ-氨基丁酸(GABA)菌株的筛选后,利用紫外线进行诱变处理,得到GABA突变菌株,并对其进行了菌种鉴定。结果表明,从80株供试乳酸菌中筛选出4株高产γ-氨基丁酸的菌株,再经紫外诱变后得到1株高产突变菌株US3-3。该菌株紫外诱变后,其γ-氨基丁酸含量为2.482 g/L,是诱变前提高1.9倍,并对其多次传代稳定性较好,经16S rDNA序列分析,鉴定为乳酸片球菌(Pediococcusacidilactici)。

γ-氨基丁酸,乳酸菌,紫外诱变,鉴定

γ-氨基丁酸(γ-Aminobutyric acid,简称GABA),广泛存在于自然界中,是人和动物体中非常重要的非蛋白质氨基酸[1],具有降血压[2]、治疗癫痫[3]、抗焦虑[4]等多种生理功能。

γ-氨基丁酸的制备方法有很多种[5],其中微生物合成法因其条件温和、安全性高而得以广泛应用于食品生产中。乳酸菌是安全微生物,在食品工业中应用十分广泛[6]。国内很多学者研究利用乳酸菌进行发酵生产GABA,许建军等通过筛选高产的安全菌种以及优化培养条件,GABA的合成水平达到200 g/L以上。Nomura M[7]等从生产奶酪的菌株中分离到Lactococcus lactis 01-7,用于奶酪生产,其GABA含量达到383 mg/kg。2005年Komatsuzakin[8]等从传统发酵食品中分离得到1株乳酸菌(Lactobacillusparacasei)NFRI7415,其产GABA的能力达到了302 mmol/L。

本文从供试乳酸菌中筛选出高产GABA的菌株,然后利用紫外线对其进行诱变处理,筛选出高产GABA的诱变菌株,并进行菌种的鉴定,为今后工业化生产GABA提供理论基础。

1　材料与方法

1.1材料与仪器

乳酸菌供试乳酸菌80株(全部乳酸菌由内蒙古农业大学实验室提供,从酸菜、酸奶、马奶酒等传统发酵食品中分离并初步鉴定的经编号的菌株);MRS培养基蛋白胨10 g/L、牛肉膏5 g/L、酵母粉4 g/L、葡萄糖20 g/L、Tween 80 1 mL/L、磷酸二氢钠2 g/L、无水乙酸钠5 g/L、柠檬酸钠2 g/L、硫酸锰0.02 g/L、硫酸镁0.1 g/L,调节pH至6.2左右,121 ℃、15 min灭菌;MRS固体培养基加琼脂15 g/L;GYP种子培养基[7]葡萄糖10 g/L、酵母膏10 g/L、蛋白胨5 g/L,无水乙酸钠5 g/L、硫酸镁0.02 g/L、硫酸锰0.01 g/L、氯化钠0.01 g/L,pH为自然值;GYP发酵培养基在GYP种子培养基中添加3%的L-谷氨酸钠、0.4 g/L的维生素B6和0.3%的氯化钙。

γ-氨基丁酸(含量≥99%)Sigma公司;Ezup柱式细菌基因组DNA抽提试剂上海生物工程有限公司;L-谷氨酸钠国药集团化学试剂有限公司维生素;B6Sigma公司;氯化钙国药集团化学试剂有限公司;四硼酸钠 硼酸天津市永大化学试剂有限公司;重蒸苯酚国药集团化学试剂有限公司;次氯酸钠天津市永大化学试剂有限公司。

SW-CJ-2D双人单面垂直净化工作台苏州安泰空气技术有限公司;LRH-150系列生化培养箱上海一恒科技有限公司;KDC-140HR台式高速离心机安徽中科中佳科学仪器有限公司;DSH-300A旋转式恒温振荡器上海雅荣生化设备仪器有限公司;FR980凝胶成像仪上海复日科技仪器有限公司;T6新悦-可见光分光光度计北京普析通用仪器有限责任公司。

1.2实验方法

1.2.1高产γ-氨基丁酸乳酸菌的筛选将供试乳酸菌在MRS液体培养基活化两代后,按3%接种至GYP培养基中,37 ℃培养36 h,在12000 r/min下离心15 min,取上清液测定其γ-氨基丁酸的含量(比色法[8-10]),筛选出产量较高的菌株。

1.2.2筛选菌株的紫外诱变

1.2.2.1悬菌液的制备将菌株以3%的接种量接种于GYP发酵培养基中,培养至对数期后,取20 mL菌液离心(3000 r/min,10 min)弃上清液,用无菌生理盐水沉淀溶解,调整菌数约为107～108CFU/mL[11],然后进行紫外诱变处理。

1.2.2.2菌株紫外诱变最佳条件的选择将10 mL调整后悬菌液置于培养皿中,在黑暗条件下,置于30 W紫外灯下35 cm处,分别照射0、20、40、60、80、100、120 s,将照射后的菌液稀释适当倍数并平板涂布培养进行菌落计数,计算紫外致死率,选取最佳致死率时间作为诱变计量。

致死率(%)=诱变处理前的总菌数-诱变处理后存活菌数/诱变致死前的总菌数×100

1.2.2.3突变菌株性能稳定性的研究采用连续传代方法检测突变菌株遗传稳定性,将筛选出的目的菌株连续培养7代,测定发酵液中γ-氨基丁酸的含量。

1.2.3目的菌株的分子生物学鉴定

1.2.3.1总DNA的提取采用乳酸菌专用CTAB冻融法提取菌株基因组DNA[12]。

1.2.3.2PCR扩增16S rDNA序列扩增引物采用通用引物[13],正向引物为A27F:5′-AGTTTGATCTTGG CTC-3′,反向引物为A1492R:5′-GGTTACCTTGTTA CGACTT-3′。PCR反应体系:10×PCR缓冲液2.5 μL,正、反引物各0.5 μL,dNTP1 μL,基因组DNA 0.5 μL,酶0.2 μL,双蒸水补充至25 μL。PCR扩增条件:94 ℃预变性5 min,94 ℃变性1 min,56 ℃退火45 s,72 ℃延伸2 min,共进行34个循环,再72 ℃延伸10 min,PCR产物测定由上海生物工程技术公司完成。

1.2.3.3同源性分析和系统发育树的构建利用BLAST将所测定菌株与数据库中已知细菌的16S rDNA序列进行比较,寻找与目的基因序列同源性最高的已知分类地位的菌种。最后利用MEGA软件进行同源性分析并绘制系统发育树。

2　结果与讨论

2.1供试菌株产γ-氨基丁酸的能力

市售标准γ-氨基丁酸的标准曲线如图1。

图1　γ-氨基丁酸标准曲线Fig.1　Standard curve of γ-Aminobutyric acid

从标准曲线图1可以看出线性回归方程为y=0.999x+0.013,相关系数R2=0.9991。当γ-氨基丁酸浓度在0.20～1.00 mg/mL时呈良好的线性关系。

根据γ-氨基丁酸标准曲线,对80株供试乳酸菌进行初筛和复筛(37 ℃，36 h),获得4株产γ-氨基丁酸较强的菌株(见表1),并将4株菌株作为出发菌株进行紫外诱变处理。

表1　筛选各菌株GABA产量Table 1　GABA-production of different strains

2.2出发菌株紫外诱变最佳条件的确定

将处于最佳菌龄期的高产γ-氨基丁酸的各出发菌株的菌液制备成107～108CFU/mL的菌悬液,取10 mL调整后悬菌液置于培养皿中,在黑暗条件下,置于紫外灯下照射一定时间(0、20、40、60、80、100、120 s)后得到致死率情况见图2。

图2　紫外诱变菌株的致死率曲线图Fig.2　Lethality curve of strains under UV mutagenesis

根据文献报道[14],一般把致死率在70%～80%的范围作为紫外诱变最佳时间。由图2可知,菌株S3-3、S4-5、Sc6-2和18M376分别在紫外灯下照射60、40、40和80 s时致死率达到菌株发生正突变的要求。因此确定各出发菌株进行紫外诱变的最佳条件为:在30 W紫外灯下、照射距离为35 cm,菌株S3-3、S4-5、Sc6-2和18M376分别照射60、40、40和80 s。

2.3筛选菌株紫外诱变效果

将各出发菌株在最佳紫外诱变的条件下进行多次诱变筛选,γ-氨基丁酸含量变化结果如图3。

图3　紫外诱变后各菌株产γ-氨基丁酸的变化图 Fig.3　The production of γ-Aminobutyric acid of original strains under UV mutagenesis

由图3可知,4株出发菌株S3-3、S4-5、Sc6-2和18M376较原始菌株产γ-氨基丁酸的能力均有所提高,其中菌株S3-3由原来的1.293 g/L提高到2.482 g/L,是紫外诱变前的1.9倍,较出发菌株提高了92%。将突变菌株命名为US3-3。

2.4突变菌株的遗传稳定性

将突变菌株US3-3在GYP培养基上经过连续7次传代培养,观察其生长状态和产γ-氨基丁酸的能力的稳定性,结果见图4。

图4　菌株产γ-氨基丁酸稳定性测定的结果Fig.4　Genetic stability of GABA-producing strains

由图4可知,菌株US3-3连续传代培养7次后,γ-氨基丁酸的产量仍基本保持稳定,含量在2.412～2.513 g/L之间,变化幅度很小,且γ-氨基丁酸的产量得到稳定提高,有较好的遗传稳定性,这表明经紫外线诱变后菌株可能发生了基因突变[15],故将菌株US3-3作为目的菌株进行分子生物学鉴定。

2.5菌株US3-3的16S rDNA扩增与测序

菌株US3-3的16S rDNA的PCR扩增产物用质量分数为1.0%的琼脂糖凝胶电泳检测,电泳结果见图5。

图5　菌株的16S rDNA PCR扩增产物Fig.5　16S rDNA PCR amplification of strain US3-3

由图5可知,突变菌株US3-3在1500 bp左右处出现特异性荧光条带,能满足后续进行16S rDNA序列测定的需要。

2.6菌株US3-3的序列比对及系统发育分析

将目的菌株US3-3的16S rDNA序列与GenBank 数据库中已知的7株标准菌序列运用MEGA4.0软件构建系统发育树,见图6。

图6　基于16SrDNA序列乳酸菌的系统发育树Fig.6　Dendrogram of lactic acid bacteria based on 16S rDNA sequence

将菌株US3-3的16S rDNA基因序列与7株标准菌株的基因序列BLAST后发现,该菌株与乳酸片球菌(PediococcusacidilacticiEU147310)的同源性最高。然后将该菌的16S rRNA基因序列与GenBank数据库中已知的乳酸片球菌近缘菌株进行多序列比较,用MEGA4绘制系统发育树(如图6),结果表明菌株US3-3与乳酸片球菌(Pediococcusacidilactici)的同源性为100%,因此鉴定该菌株为乳酸片球菌(Pediococcusacidilactici)。

3　结论

以GYP发酵培养基为发酵基质,以GABA为测定指标,从80株供试乳酸菌中筛选出4株产γ-氨基丁酸较强的菌株,分别是Sc6-2、18M376、S4-5和S3-3,将其作为紫外诱的出发菌株。

对4株产γ-氨基丁酸较强的菌株进行紫外诱变处理结果,紫外诱变最佳条件为30 W紫外灯下、照射距离为35 cm,分别照射60、40、40、80 s。

在最佳紫外照射条件下,筛选出一株稳定的高产GABA突变菌株US3-3,其γ-氨基丁酸含量为2.482 g/L,是诱变前提高1.9倍。经鉴定菌株US3-3为乳酸片球菌(Pediococcusacidilactici)。

[1]叶惟泠.γ-氨基丁酸的发现史[J]. 生理科学进展,1968,17(2):187-189.

[2]徐林敏,张充,陆兆新,等.γ-氨基丁酸产生菌的筛选及培养基优化[J].生物工程,2014,23(35):238-239.

[3]LI Haixing,CAO Yusheng. Lactic acid bacterial cell factories for gamma-aminobutyric acid[J]. Amino Acids,2010,39(5):1107-1116.

[4]曾小群,胜娇铃,潘道东.新疆算买奶中产γ-氨基丁酸乳酸菌的筛选与鉴定[J].中国食品学报,2013,13(10):191-196.

[5]杨晶晶,曲媛,崔秀明.γ-氨基丁酸的制备方法与含量测定研究进展[J].食品工业科技,2014,35(3):351-356.

[6]朱晓立,邓毛程.γ-氨基丁酸乳酸菌分离筛选与微波诱变育种[J].中国酿造,2009,210(9):41-44.

[7]Nomoram,Kmotoh,Someyay. Production of γ-aminobutyric acid by cheese starters during cheese ripening[J]. J Dairy Sci,1998,81(6):1486-1491.

[8]Komatsuzakin,Shimaj,Kawanmotos. Production of γ-aminobutyric acid(GABA)by Lactobacillus paracasei isolated from traditional fermentedfoods[J]. Food Microbiol,2005,22(6)497-504.

[9]Yokoya Sadaji,Hiramatsu Jun-ichi,Hayakawa Kiyoshi. Production ofγ-aminobutyric acid from alcohol distillery less by Lactobacillus brevis IFO-12005[J]. Journal of Biosience and Bioengineering,2001,93(1):95-97.

[10]田东亮.转化法合成γ-氨基丁酸的霉菌筛选及条件优化[D].济南:齐鲁工业大学,2013.

[11]杨丽丽,赵城彬,吴非.乳酸菌发酵米糠产γ-氨基丁酸最适条件的研究[J].食品工业科技,2012,33(16):217-219.

[12]陈恩成,张名位,彭超英,等. 比色法快速测定糙米中γ-氨基丁酸含量研究[J].中国粮油学报,2006,26(1):125-127.

[13]杨春宇.丁醇耐受菌株复合诱变的研究[D].大庆:黑龙江八一农业大学,2013.

[14]F.奥斯伯,R.布伦特编.颜子颖,王海林译.精编分子生物学实验指南[M].北京:科学出版社,1998.

[15]张刚.乳酸菌-基础、技术和应用[M].北京:化学工业出版社,2007:174-176.

[16]吕红线,林建群,林建强.L-乳酸高产菌株的诱变选育[J].中国酿造,2008,185(8):8-10.

[17]Strom K,Sjogren J,Broberg A,et al.LactobacillusplantarumMiLAB 393 produces the antifungal cyclic dipeptides cyclo(L-Phe-L-Pro)and cyclo(L-Phe-trans-4-OH-L-Pro)and 3-phenyllactic acid[J]. Appl Environ Microbiol,2002,68(9):4322-4327.

Study on mutation breeding and identification of lactic acid bacteria forγ-aminobutyric acid production

SHUANG Quan,WAN Yue,LIU Li

(Inner Mongolia Agricultural University,College of food science and Engineering,Hohhot 010018,China)

The growth ability of 80 lactic acid bacteria strains isolated from the traditional fermented food in Inner Mongolia were screened according to theγ-aminobuyric acid(GABA)accumulation amount in the GYP medium. The high-yield GABA strains were obtained by ultraviolet mutagenesis,and then the strain was identified by 16S rDNA gene sequences. The results showed that 4 high-yield GABA strains were screened out from 80 strains of lactic acid bacteria and a high yield GABA producing strain US3-3 was obtained by UV mutagenesis and its content of GABA was 2.482 g/L,which was 1.9 times as much as original strain. The strain US3-3 was identified asPediococcusacidilactici.

γ-aminobutyric acid(GABA);lactic acid bacteria;screening;ultraviolet mutagenesis;identification

2015-06-19

双全(1964-)，男，博士，教授，研究方向：食品科学，E-mail：shuangquan@imau.edu.cn。

国家自然科学基金(31460443)。

TS252.5

A

1002-0306(2016)03-0153-04

10.13386/j.issn1002-0306.2016.03.024