lncRNA SPRY4-IT1在肝癌中的作用研究

李培磊 展洋洋 张铭健 刘芳 殷鹏 傅志仁★

lncRNA SPRY4-IT1在肝癌中的作用研究

李培磊 展洋洋 张铭健 刘芳 殷鹏 傅志仁★

目的 研究长链非编码RNA SPRY4-IT1（lncRNA SPRY4-IT1）在肝细胞肝癌（HCC）中的表达，及其对肝癌细胞系Hep G2恶性生物学表型的调控作用。方法 收集2013年9月至2014年12月60例肝癌及癌旁组织样本，利用荧光定量聚合酶链式反应（PCR）检测lncRNA SPRY4-IT1在肝癌组织中的表达，并检测lncRNA SPRY4-IT1在人源性肝癌细胞系Hep G2、HHCC、SK-HEP-1中的表达；利用小干扰RNA沉默Hep G2细胞内lncRNA SPRY4-IT1表达，分别进行Transwell 细胞迁移、侵袭及CCK8细胞增殖实验；建立肝癌裸鼠成瘤模型，观察干扰lncRNA SPRY4-IT1表达后荷瘤小鼠肿瘤生长的情况。结果 比较癌旁组织，lncRNA SPRY4-IT1肝癌组织中的表达显著上升（P=0.0109）；比较正常人肝细胞系L02，lncRNA SPRY4-IT1在肝癌细胞系Hep G2、HHCC、SK-HEP-1中表达明显升高（P均＜0.01），且在Hep G2中上调尤为显著。干扰lncRNA SPRY4-IT1表达后，Hep G2细胞的迁移和侵袭并未受到明显影响（P＞0.05），然而其体外增殖活性受到显著抑制（P＜0.01）；荷瘤小鼠的肿瘤生长也明显受到抑制（P＜0.01）。结论 长链非编码RNA SPRY4-IT1在HCC中高表达，并通过促进肝癌的增殖而发挥重要的生物学功能，可能是HCC潜在的治疗靶点。

肝细胞肝癌 长链非编码RNA SPRY4-IT1 增殖 迁移 侵袭

肝癌是世界上最为常见的肿瘤之一，在我国的恶性肿瘤中位居第三［1］。肝癌根据细胞类型分为肝细胞肝癌（Hepatocellular carcinoma，HCC）和肝胆管细胞肝癌，其中HCC所占比例高达90%［2］。HCC是一种多基因突变的疾病，其发生发展中伴随复杂的分子机制。长链非编码RNA（long non-coding RNA，lncRNA）是一种长度约为200nt的非编码RNA，是基因转录的“垃圾产物”［3］。多项研究表明lncRNA SPRY4-IT1在黑色素瘤、胃癌、肾透明细胞癌、乳腺癌中高表达，且与恶性肿瘤的生长、转移和预后等具有紧密相关性［4～7］。而关于lncRNA SPRY4-IT1在HCC中所发挥的生物学功能研究仍未见报道。本文将对lncRNA SPRY4-IT1在肝癌中的表达情况及其所发挥的生物学效应做进一步研究，以期为HCC治疗寻找新的分子靶点。

1 临床资料

1.1 一般资料 经患者知情同意，收集2013年9月至2014年12月本中心60例HCC患者手术切除标本（癌旁及癌组织）。其中男43例，女17例；年龄40～75岁，平均（53.02±2.3）岁。所有患者术前未行放化疗及介入等干预措施，手术均为根治性切除术，留取肿瘤组织及距离肿瘤组织＞5cm的癌旁组织。肿瘤基本情况：肿瘤直径1.3～7.1cm，平均（4.6±1.7）cm。术后病理结果显示均为HCC。肿瘤标本取下后立即放入液氮中冻存。

1.2 试剂与仪器 DMEM培养液及胎牛血清购自美国Gibco公司。lncRNA SPRY4-IT1干扰序列（siSPRY4-IT1）、阴性对照序列（siNC）及GAPDH引物序列由上海吉玛公司合成。RNA转染试剂INTERFERin购自美国Polyplus-tansfection公司。in vivo-JetPEI购自法国Polyplus Transfection公司。Trizol试剂购自美国Invitrogen公司。RNA逆转录试剂盒购自美国GeneCopoeia公司。相对荧光定量聚合酶链式反应（PCR）试剂盒购自日本Takra公司。Transwell细胞迁移检测试剂盒购自美国Chemicon公司。CCK8细胞增殖检测试剂盒购自美国Yeasen公司。ABI-7500实时荧光定量PCR仪购自美国ABI公司、5424R冷冻离心机购自德国Eppendorf公司。Epoch96孔板微量分光光度仪购自美国Biotek公司。BX53 奥林巴斯显微镜购自日本Olympus 公司。Tissuelyser-192全自动样品快速研磨仪购自上海净信科技有限公司。

1.3 方法 （1）细胞培养及RNAi干扰：所有细胞均使用含10%浓度胎牛血清的DMEM培养液，在5%CO2、37℃、相对湿度90%条件下进行培养。Hep G2细胞培养至对数生长期时采用INTERFERin转染试剂并按试剂说明书进行lncRNA SPRY4-IT1干扰序列（siSPRY4-IT1）及阴性对照序列（siNC）的转染。siSPRY4-IT1序列为：5'-CCCAGAATGTTGACAGCTGCCTCTT-3'，以无义序列siNC作为阴性对照。（2）RNA提取以及实时荧光定量PCR（qRT-PCR）：取100mg冻存的组织，采用全自动样品快速研磨仪充分研磨，加入1ml Trizol试剂进行RNA的提取。取1×107个细胞，加入1ml Trizol试剂进行RNA提取。抽提后的RNA采用96孔板微量分光光度仪在波长260nm及280nm下进行浓度及纯度的检测，A260/A280为1.8～2.1说明样品纯度合格。采用RNA逆转录试剂盒并按照操作说明书进行RNA的逆转录。qRT-PCR按照SYBR Green试剂盒说明书进行反应体系的配制，以GAPDH作为内参，每个样本设置3个复孔。引物序列如下：lncRNA SPRY4-IT1：Forward：5'-AGCCACATAAATTCAGCAGA-3'；Reverse：5'-CGATGTAGTAGGATTCCTTTCA-3'；GAPDH：Forward：5'-GGGAGCCAAAAGGGTCAT-3'；Reverse：5'-GAGTCCTTCCACGATACCAA-3'。（3）Transwell检测Hep G2细胞迁移和侵袭：在迁移分析中，各组细胞以3×104个/孔接种于24空Transwell小室，每组设置3个复孔，上室加入100μl DMEM无血清培养液，下室加入600μl含10%胎牛血清DMEM培养液，37℃细胞培养箱中培养48h后取出上室，吸取下室中培养液，加入结晶紫染色液100μl/孔，染色15min，PBS洗涤2遍，100倍显微镜下选取5个视野观察细胞并计算平均值。在侵袭分析中，小室以基质膜包被，后续步骤同迁移分析。（4）CCK8检测Hep G2细胞增殖：取对数期生长的Hep G2细胞，以2×105/孔接种于96孔板，加入含10%胎牛血清的DMEM培养液200μl/孔，每组设置6个复孔，以不含细胞的空白培养基作为对照。加入CCK8试剂1次/d 37℃孵育30min后，于450nm波长下测定吸光光度值。连续测定72h。（5）肝癌裸鼠移植瘤模型的建立：取对数生长期的Hep G2细胞，消化细胞后采用DMEM调整细胞浓度为2×107/ ml。取16只裸鼠，于每只裸鼠右后肢外侧皮下注射100μl Hep G2细胞悬液成瘤。自第2周开始使用游标卡尺测量瘤体的长径（a）和短径（b），并计算瘤体体积，公式为：瘤体体积=4/3×π×r3［r=（a+b）/4］。（6）动物分组及处理：Hep G2细胞接种1周后，将16只裸鼠随机平均分为siNC对照组和siSPRY4-IT1处理组。siNC对照组：瘤体内多点注射jetPEI/siNC复合物（15μg siNC及 2.4μl JetPEI）；siSPRY4-IT1处理组：瘤体内多点注射jetPEI/siSPRY4-IT1复合物（15μg siSPRY4-IT及 2.4μl JetPEI）。复合物均采用0.9%生理盐水稀释至20μl。

1.4 统计学方法 采用SPSS17.0统计软件。计量资料以（±s）表示，组间比较采用t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 lncRNA SPRY4-IT1在HCC中的表达及RNAi干扰效果 采用qRT-PCR对60例肝癌及相对应的正常癌旁组织中lncRNA SPRY4-IT1的内源性表达进行检测。与相应正常癌旁组织比较，肝癌组织中lncRNA SPRY4-IT1相对表达发生显著上调（P=0.0109）。同样采用qRT-PCR对lncRNA SPRY4-IT1在人来源的肝癌细胞系中的表达进行检测，与L02人正常肝细胞系比较，lncRNA SPRY4-IT1在Hep G2、HHCC、SK-HEP-1肝癌细胞系中的表达均显著上升（P＜0.01），且在Hep G2中上调最为显著（P=0.0001）。采用lncRNA SPRY4-IT1的干扰小RNA siSPRY4-IT1转染Hep G2细胞，检测siSPRY4-IT1的干扰效率，转染siSPRY4-IT1后，lncRNA SPRY4-IT1的表达发生显著下调（P＜0.01）。

2.2 lncRNA SPRY4-IT1对肝癌细胞迁移和侵袭的影响 采用Tanswell实验，对转染siNC以及转染siSPRY4-IT1的Hep G2细胞迁移和侵袭能力进行检测。如图1所示，与未转染组及转染siNC组比较，转染siSPRY4-IT1组细胞迁移数和侵袭数差异无统计学意义（P＞0.05）。结果提示lncRNA SPRY4-IT1对肝癌细胞的迁移无影响。

图1 1ncRNA SPRY4-IT1对肝癌细胞迁移和侵袭的影响

图3 采用CCK8细胞增殖实验检测干扰1ncRNA SPRY4-IT1表达后细胞增殖情况

图4 转染siNC以及si SPRY4-IT1的Hepa G2细胞种植于裸鼠后的瘤体大小

2.3 lncRNA SPRY4-IT1对肝癌细胞增殖的影响 为进一步探究lncRNA SPRY4-IT1在肝癌中发挥的生物学效应，采用CCK8细胞增殖实验检测了干扰lncRNA SPRY4-IT1表达后，细胞增殖的情况。比较未转染组和转染siNC组，转染siRNA SPRY4-IT1组细胞增殖数目显著降低（P＜0.01），细胞增殖速度也受到抑制。

2.4 lncRNA SPRY4-IT1对裸鼠移植瘤生长的影响 将转染siNC以及si SPRY4-IT1的Hep G2细胞分别种植于裸鼠皮下，构建裸鼠移植瘤模型，观察裸鼠瘤体的生长情况。与siNC组小鼠比较，si SPRY4-IT1组裸鼠移植瘤生长受到显著抑制，差异具有统计学意义（P＜0.01）。

3 讨论

生物基因组中数量庞大的非编码序列的功能一直备受关注，随着生物技术的不断进步，逐渐发现非编码RNA在细胞正常生理代谢及调控中所具有的重要作用，并且其表达的异常与多种疾病，尤其是与肿瘤发生发展有着紧密的关系［8］。近年来，多种lncRNA在调控肿瘤恶性生物学表型中发挥着重要的功能，是肿瘤最具潜力的治疗靶点。因此探究HCC中异常表达的lncRNA及其发挥的生物学功能，对于寻找肝癌的分子治疗靶点，改善患者预后具有重要的科研价值和临床意义。

lncSPRY4-IT1是一种706个碱基序列的转录产物，研究显示其位于SPRY4基因序列的内含子中，但其转录调控及作用功能与SPRY4基因相互独立［9］。本资料中，lncSPRY4-IT1在肝癌中的表达上升，进一步在细胞中检测lncSPRY4-IT1发现其在肝癌细胞系中表达也显著高于正常肝细胞，提示lncSPRY4-IT1在肝癌中的异常过表达可能在肝癌的发生发展中起着重要的调控作用。有研究报道，lncSPRY4-IT1在胃癌［4］、膀胱癌［10］以及黑色素瘤［5］中发生显著的上调表达，干扰其表达后可以显著抑制细胞的迁移。作者在肝癌中干扰lncSPRY4-IT1的表达后，同样对细胞的迁移进行了检测，但细胞的迁移并未受到明显抑制。因此作者推测lncSPRY4-IT1虽然在多种类型的肿瘤中发生异常表达，但在不同类型的肿瘤中发挥着不同的生物学功能。本资料中，干扰lncSPRY4-IT1表达后，肝癌细胞的增殖亦明显受到抑制。利用肝癌裸鼠移植瘤模型，在体内进一步验证lncSPRY4-IT1的促肿瘤作用，结果显示干扰lncSPRY4-IT1后，裸鼠移植瘤的生长也受到显著抑制。说明肝癌中过表达的lncSPRY4-IT1对肿瘤细胞的增殖有明显的促进作用。

随着分子生物学技术的不断突破，关于深入研究lncRNA的作用机制成为可能。目前推测lncRNA的作用机制有：（1）lncRNA可以结合转录因子蛋白，调控转录因子活性，进而调控基因的表达。（2）lncRNA可以作用于染色体的空间构象或者结合mRNA从而调控基因的表达。（3）lncRNA可以通过吸附内源性microRNA，通过调控microRNA的功能而达到调控基因的表达目的等。lncRNA不同于研究比较成熟、作用机制较为明确的microRNA，其研究尚处于早期阶段，作用机制复杂，本资料肝癌中lncRNA发生上调的分子机制以及其促进肿瘤增殖的作用机制仍有待于进一步研究。

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Objective This research aimed to observe the expression of long non-coding RNA SPRY4-IT1 in hepatocellular carcinoma（HCC）and its regulation on malignant biological functions of HepaG2. Methods Quantitative real-time polymerase chain reaction（qRT-PCR）was used to detect the lncRNA SPRY4-IT1 expression in HCC on 60 paired cancerous and adjacent tissue samples，also we observed the lncRNA SPRY4-IT1 expression in Hep G2、HHCC、SK-HEP-1；Small interfering RNA was used to suppress lncRNA SPRY4-IT1 expression in Hep G2；then we used CCK-8 assays and Transwell experiment to investigate the function of lncRNA SPRY4-IT1 in HCC；nude mice model was performed to observed the tumor size after interfering lncRNA SPRY4-IT1 expression. Results We found remarkable elevated lncRNA SPRY4-IT1 expression in cancerous tissues compared with adjacent non-cancerous tissues（P=0.0109）；lncRNA SPRY4-IT1 expression markedly increase in Hep G2、HHCC、SK-HEP-1 （P＜0.01），especially in Hep G2；the migration and invasion had not been obviously affected（P＞0.05）while the proliferation was significantly inhibited（P＜0.01）after silence the expression of lncRNA SPRY4-IT1 in HepG2 cells；the tumor size of nude mice was also suppressed after interfering lncRNA SPRY4-IT1 expression. Conclusion Long non-coding RNA SPRY4-IT1 is highly expressed in hepatocellular carcinoma.It plays an important role in biological function by promoting the proliferation of hepatocellular carcinoma.Long non-coding RNA SPRY4-IT1 may be an important molecular marker and a potential therapeutic target of hepatocellular carcinoma.

Hepatocellular carcinoma Long non-coding RNA SPRY4-IT1 Proliferation Migration Invasion

200010 上海市长征医院器官移植中心