胰腺导管腺癌细胞系研究进展

杨建宇 孙勇伟 花荣

胰腺癌约占全身所有恶性肿瘤的2%，它是一种恶性程度极高，早期难以诊断，预后极差的恶性肿瘤，其中超过90%的类型为导管腺癌(PDAC)[1]。胰腺癌细胞系是用于了解胰腺癌生物学特征，阐明其发生、发展规律并寻找有效诊治方法的重要实验材料。自Dobrynin等[2]1963年建立了第一个胰腺癌细胞系CAPA以来，美国、日本、中国、德国及以色列等国的科学家已相继建立了近百个人胰腺癌细胞系供科研使用，其中大多数为PDAC细胞系。本文就PDAC细胞系的建立及其在胰腺癌研究方面取得的一些进展做一综述。

一、PDAC细胞系的建立

1．PDAC细胞系建立方法：PDAC细胞系的建立方法主要包括：(1)常规原代培养法：常规建系是经剪切分离法、机械分散法或消化分离法将人或动物的胰腺肿瘤组织块制备成单细胞悬液，原代培养后经传代获得。新鲜瘤组织接种于裸鼠成瘤后取材培养更易建系。北京协和医院病理科从一57岁女性胰头中分化腺癌的标本中取材后经剪切分离法培养得到了PC-3细胞系[3]。Liu等[4]将人胰腺癌手术标本直接移植于裸小鼠胰腺内，通过肿瘤异体移植和连续传代成功获得能产生大量癌胚抗原(CEA)的PTNMP-2 PDAC细胞系。(2)化学物质诱导法：Chen等[5]利用阿霉素(ADM)体外浓度梯度倍增法诱导培养人胰腺癌细胞株SW1990得到耐药细胞株SW1990/ ADM。SW1990/ADM形态学上发生了明显的改变，其倍增时间延长以及对4种化疗药物5-氟尿嘧啶(5-FU)、吉西他滨、ADM及丝裂霉素(MMC)均显示出一定的耐药性,尤以对ADM和MMC最为明显。Guo等[6]利用相似的方法建立了SW1990/ FU细胞系。

2．目前已建立细胞系及其特点：目前特征明确、广泛使用的PDAC细胞系有PANC1、SW1990、SUIT-4、AsPC-1、PK-1、HPAC、CFPAC-1、PL-45、PaCa5061等(表1)。国内建立较早并且广泛使用的为北京协和医院病理科于1992年建立的PC-3细胞系[3]。研究显示虽然有些细胞系已经连续培养使用了近40年，但长时间的培养传代不会导致其基因结构与亲本肿瘤基因产生明显差异[7]。

PANC1、PK-9、JoPaca-1、PC-3、BxPC-3、PL45、HPAC、MIA PaCa-2、KMP-4、PP109及PaCaDD-43细胞系建自胰腺癌患者原发灶。JF305细胞系建自裸鼠移植瘤。CFPAC-1，SUIT-2，RWP-1，RWP-2，PK-1、-8、-12，CaPan-1和KMP-1、-2、-5、-6细胞系建自胰腺癌患者肝转移灶。SW1990细胞系建自胰腺癌患者脾脏转移灶，KMP-3和PaCaDD-135细胞系建自胰腺癌患者的转移淋巴结。而HPAF-Ⅱ、AsPC-1及SUIT-4细胞系建自患者癌性腹水，p34、MZ-PC-1和PaCaDD-60细胞系建自癌性胸水。

PDAC细胞系染色体数目多为非整倍体，如PaCa5061、p34、PANC1为超三倍体，CFPAC-1为超二倍体，MIAPaCa-2为亚三倍体，CaPan-2为假三倍体。胰腺癌细胞系中最显著的染色体异常为8号染色体的改变[8]。Sato等[9]曾报道8号染色体的异常与恶性肿瘤的生长及侵袭性相关。此外某些细胞系还包含特异性的染色体异常，如SW1990及SUIT-4细胞系Y染色体的缺失[10-11]，p34细胞系中2号染色体短臂的缺失[8]。胰腺癌有独特的基因特征：K-ras基因突变概率超过95%，p16突变率几乎为100%[12]，p53及DPC4的突变率都超过50%，DPC4基因失活的概率大约为50%[13](表2)。某些细胞系还有其独特的基因表达，PaCa5061最突出的过表达基因为Mucin 4和癌胚抗原家族相关分子CEACAM-1、CEACAM-5和CEACAM-6[14]；CFPAC-1表达囊性纤维化基因(CF)[15]；SUIT-4表达某些金属蛋白酶(MMP)基因和金属蛋白酶抑制剂(TIMP)基因[11]；HPAC则为第一个被报道的具有表达功能性糖皮质激素受体的人胰腺癌细胞系[16]。

虽然胰腺癌的侵袭转移能力很强，但有报道显示仅有5个细胞系(CaPan-1、SUIT-2、PCT-1、SUIT-4 和 PaCa5061)会在裸鼠体内自发转移到区域淋巴结、肺或腹部器官。其中SUIT-4和PaCa5061可转移到肺组织，PaCa5061具有高侵袭性可以在75%的实验动物体内发生转移[11,14]。Luo等[17]于2012年建立了国内首个在裸鼠体内具有高侵袭性、高淋巴转移能力的BxPC-3-LN细胞系。CaPan-1、CaPan-2、CFPAC及MPanc96对人有神经侵袭性，其中具有高神经侵袭性的CaPan-1和CaPan-2对小鼠也显示有神经侵袭性。具有低神经侵袭性的HPAF-Ⅱ、AsPC-1及PANC1在人和小鼠身上都没有发现有神经侵袭性[18]。

表1 常见国内外已建立的PDAC细胞系

表2 胰腺癌基因改变

从PDAC细胞系产物上来看，绝大部分的细胞系都会产生CA19-9及CEA等肿瘤标记物。SUIT-2细胞系是第一个被报道的分泌CA19-9的人胰腺癌细胞系[19]。到目前为止，在所有报道的PDAC细胞系中SUIT-4的CA19-9的表达量最高。有报道显示肿瘤的体积与血清中的CA19-9水平呈正相关性[11]。此外，KMP细胞系会分泌鳞状细胞癌抗原(SCC)及细胞角蛋白19片段，CaPan-1可分泌胃型黏蛋白。一般来说，胰腺导管来源的肿瘤不产生胰腺相关酶类，如在SW1990、MIAPaCa-2和PANC1，而COLO357细胞系可产生胰淀粉酶、胰蛋白酶及糜蛋白酶，PK-8和PK-9细胞系也会产生胰蛋白酶。

二、胰腺癌细胞系的用途

1．分子生物学研究：胰腺癌细胞系K-ras基因的突变几乎都局限在12密码子上，如SUIT-4、PANC1、KP-3、PaCa-2、BxPC-3、KP-2、AsPC-1和SUIT-2。而其中最常见的为发生在第2位置上由GGT到GAT的突变。PDAC中所有p53的突变均为点突变。到目前为止，胰腺癌细胞系的表现型与其基因突变并无明确关系。有研究表明K-ras基因突变是PDAC发生中的早期事件，而p53基因突变则代表了导管恶性肿瘤进展中从低等级发展到高等级的过程[20]，p53基因的状态还与胰腺癌体内转移行为相关[21]。但也有研究表明K-ras、p53、p16及MADH4基因的突变状态与胰腺癌细胞的分化及生物学行为并无关系[22-23]。

细胞因子具有广泛调节功能，它不仅作用于免疫系统、神经内分泌等系统，还在肿瘤的发生、浸润转移、凋亡过程中起着重要作用。郑正荣等[24]发现趋化因子配体16(CXCL16) 可诱导胰腺癌细胞系PANC1和AsPC-1增强对基质的粘附性、侵袭性和迁移性，并协同癌的发展。Zhang等[25]发现表皮生长因子(EGF)通过活化核因子-κB(NF-κB)促进胰腺癌细胞的尿激酶型纤溶酶原激活物(uPA)表达和侵袭力，采用NF-κB抑制剂阻断NF-κB通路有利于胰腺癌的综合治疗。此外，学者们还对转化生长因子-β(TGF-β)、β-神经生长因子(β-NGF)、胶质细胞源性神经营养因子(GDNF)等细胞因子进行了大量研究，希望能在未来胰腺癌综合治疗中找到更有效的方法。

2．肿瘤转移性及侵袭性研究：Kawano等[11]从胰腺癌患者腹水中建立了SUIT-4细胞系，并发现它是少数几个可以自发在裸鼠体内转移至区域淋巴结、肺脏及腹部器官的细胞系。同时发现MMP尤其是MMP-1在癌转移过程中起着重要的作用。肿瘤细胞微环境中的信号物质对肿瘤细胞侵袭能力的影响备受关注，这些信号物质包括两类：趋化因子和神经递质。郭坤等[26]通过逆转录-聚合酶链反应以及Transwell侵袭实验等方法研究发现经典神经递质——去甲肾上腺素通过β受体介导上调MMP-2、MMP-9和VEGF的表达而增强胰腺癌细胞的侵袭能力。Eppinga等[27]通过对BxPC-3中动力蛋白2(Dyn2)的研究发现，磷酸化Dyn2的高水平表达通过增加细胞板状伪足的生成增强了细胞的侵袭能力。De Oliveira等[28]通过对T3M4、Su8686及PANC1胰腺癌细胞系中SDC-2基因表达及其与K-ras基因关系发现，SDC-2是一个新的神经侵袭相关基因，并与K-ras协同诱导胰腺癌侵袭性的增强。

3．胰腺癌治疗的研究：随着癌基因、抑癌基因、细胞因子研究的深入及分子生物学研究手段的进步，基因治疗已向传统的肿瘤治疗方法提出挑战并日益体现出其活力。Satoh等[29]通过研究PANC1等胰腺癌细胞系与正常胰腺细胞中MSX2基因的差异表达发现其可以增强PDAC的恶性程度及其侵袭性，因此MSX2基因可应用于PDAC早期诊断及基因靶向治疗。Huang等[30]应用RNA干扰技术通过沉默PANC1中OCT4基因表达，证明了OCT4基因可抑制PANC1细胞增殖并诱导其凋亡。王葆春等[31]将合成的信号转导与转录因子3(STAT3)siRNA转染SW1990细胞，通过检测转染前后STAT3mRNA及蛋白的表达变化发现STAT3siRNA能特异性地阻断胰腺癌细胞中STAT3信号的活化，并进一步通过下调MMP-2和MMP-9的表达从而抑制胰腺癌细胞的侵袭能力。近年来研究者对USP9X、GFP-TRAIL、ACVR1B、MDR1、PTEN、KAI1、Bad等大量胰腺癌表达基因进行了深入的研究，相信未来在胰腺癌基因诊断及治疗方面会取得更多、更有临床意义的成果。

目前用于胰腺癌化疗的经典化疗药物有5-FU、吉西他滨、顺铂等，临床实践中发现胰腺癌治疗在过去10年中并未有大的提高，其主要原因在于胰腺癌对化疗的耐受。胰腺癌主要耐药机制包括胰腺癌个别基因及信号通路的改变、微环境的改变和高耐受干细胞的存在。Chen等[5]报道，SW1990/ADM耐药性与多药耐药基因mdr1的mRNA表达上调呈正相关。Hong等[32]研究发现，Nrf2基因在PANC1、AsPC-1等胰腺癌细胞系及胰腺癌组织中高表达，并在胰腺癌耐药性中起重要作用，敲除该基因后AsPC-1等细胞系对药物更敏感。

除手术外，放射治疗是目前治疗胰腺癌、预防术后复发、延长患者生存时间和提高生活质量的重要手段之一，但不同患者放疗疗效不一。吴巍巍等[33]使用6MV X线照射SW1990、CaPan-1、AsPC-1、MIAPaCa-2、PANC1、P3等6株胰腺癌细胞系后计算其存活分数，结果显示，胰腺癌细胞系MIAPaCa-2对放射治疗最敏感，CaPan-1对放射治疗最不敏感，而其他细胞系的放射敏感性无显著差异，从而为胰腺癌临床放疗的个体化提供了有效的参考。最近有研究发现MEK抑制剂可增强AsPC-1、MIAPaCa-2、PANC1等胰腺癌细胞系对辐射的敏感性，联合Akt抑制剂效果更好[34]，这将有助于提高胰腺癌患者放疗疗效。

4．其他方面研究：微小RNA(microRNA,miRNA)是一类高度保守的非编码RNA，在转录后水平调控基因表达，近年来研究发现其在PDAC诊断、治疗和预后评估中有重要作用。Szafranska等[35]通过对胰腺癌组织及6株胰腺癌细胞系miRNA表达谱的检测发现miR-196特异性表达于PDAC，可作为潜在的检测肿瘤标志物。Hwang等[36]发现低表达miR-21的BxPC3、HPAF-Ⅱ、HPAC、PANC1及PL45 PDAC细胞系对吉西他滨更敏感，因此miR-21可能成为一个潜在的治疗靶点。Laurials等[37]发现上调或下调低表达胰腺癌细胞系或高表达胰腺癌细胞系中的miR-31均可抑制肿瘤的增生转移及侵袭。

综上所述，由于胰腺癌细胞系具有各自的特殊结构及不同的生物学特性，因而对于研究胰腺癌的病因、发病机制及诊断治疗具有特殊意义。随着时代的发展，胰腺癌的发生及发展不可避免地受到了更多因素的影响，人们对它的认识也在逐步深入。胰腺癌的基础研究在很大程度上依赖于胰腺癌细胞系，建立更多在基因改变、耐药性等方面具有自身特点的细胞系有利于对胰腺癌进行更加深入的研究。

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