舒林酸对人胰腺癌细胞PANC1增殖凋亡及Wnt通路的影响

邹金艳 商建 易三凤 伍威 林军

Wnt/β-catenin信号通路直接影响胰腺癌细胞的增殖、分化和迁移。研究发现，在许多肿瘤组织中Wnt/β-catenin信号通路异常激活[1-4]。β-catenin在胰腺上皮内瘤变(pancreatic intraepithelial neoplasia, PanIN)及胰腺癌蛋白的核内高度积聚[5]。文献报道[6]，非甾体抗炎药(non-steroidal anti-inflammatory drugs, NASIDs)能抑制结肠癌组织中Wnt/β-catenin信号通路，抑制β-catenin的核聚集及β-catenin/TCF靶基因的转录。但NASIDs对胰腺癌的作用目前少有研究。本研究应用NASIDs的舒林酸处理人胰腺癌细胞PANC1，观察其对PANC1细胞增殖、凋亡及Wnt信号通路成员β-catenin表达的影响。

一、材料和方法

1．细胞增殖测定：人胰腺癌细胞PANC1购于中国科学院典型培养物委员会细胞库(上海)，常规培养、传代。取对数生长期细胞接种于96孔板，应用0.25、0.5、1.0、1.5、2.0 mmol/L的舒林酸(美国Enzo公司)分别处理PANC1细胞24、48、72 h，以不加舒林酸的细胞作为对照组。应用MTT法检测细胞的增殖，按MTT试剂盒(江苏碧云天生物科技有限公司)说明书操作。最后上酶标仪测各孔在波长490 nm处的吸光度值(A490值)。生长抑制率=实验组A490值/对照组A490值×100%。

2．细胞凋亡测定：取不同浓度舒林酸处理48 h的PANC1细胞，常规消化制备细胞悬液，按照Annexin V-FITC/PI细胞凋亡检测试剂盒说明书操作。染色完成后1 h内上流式细胞仪检测。

3．β-catenin mRNA表达检测：利用Primer Express1.5软件设计β-catenin引物，序列为5′-GTGCTATCTGTCTGCTCTAGTA-3′及5′-CTTCCTGTTTAGTTGCAGCATC-3′；内参GAPDH引物序列为5′-GAAGGTGAAGGTCGGAAGT-3′及5′-GGAAGATGGTGATGGGATT-3′。 引物由上海生工合成。取不同浓度舒林酸处理24 h的PANC1细胞以及2 mmol/L舒林酸处理12、24、48、72 h的PANC1细胞，采用Trizol(美国Invitrogen公司)提取细胞总RNA，采用RT-PCR法检测β-catenin mRNA表达。先逆转录成cDNA。PCR条件：94℃ 5 min，94℃ 45 s、58℃ 30 s、72℃ 45 s，35个循环，最后72℃ 10 min。PCR产物在1%琼脂糖凝胶电泳分离后扫描，以目的条带与内参条带灰度比值表示mRNA表达量。

4．β-catenin蛋白表达检测：取不同浓度舒林酸处理24、48 h的PANC1细胞，制作细胞爬片，采用免疫组化SP法检测β-catenin蛋白。兔抗人β-catenin多抗购自Santa Cruz公司，生物素化羊抗兔IgG购自武汉天兴生物科技有限公司，免疫组化试剂盒及DAB显色试剂盒购自武汉天兴生物科技有限公司。在400倍显微镜下阅片，按“米”字形随机选择5个视野，计算每个视野内胞质和胞核呈棕黄色的阳性肿瘤细胞，根据阳性细胞占总细胞数的百分数及染色强度进行半定量。无阳性细胞计0分，阳性细胞1%～30%计1分，31%～70%计2分，71%～100%计3分；根据着色强度依次计0、1、2、3分，两分相加，0分为阴性(-)，1～2分为弱阳性(+)，3～4分为阳性(++)，5～6分为强阳性(+++)[7]。

二、结果

1．舒林酸对PANC1细胞增殖的影响：应用0.5、1.0、1.5、2.0 mmol/L舒林酸处理后，PANC1细胞生长均受到不同程度抑制，与阴性对照组相比，差异均具有统计学意义(F值分别为80.755、91.701、134.087，P值均<0.05)，但1.5和2.0 mmol/L舒林酸处理48、72 h时的抑制率差异无统计学意义(P值分别为0.348、0.843)，其余各组间差异有统计学意义(P值均<0.05，表1、图1)。

表1 舒林酸作用PANC1细胞后A490均值及抑制率

图1 不同浓度舒林酸处理后PANC1细胞的生长曲线

2．舒林酸对PANC1细胞凋亡的影响：应用0.5、1.0、1.5、2.0 mmol/L舒林酸处理PANC1细胞48 h后，细胞早期凋亡率分别为(6.6±0.7)%、(9.3±1.4)%、(23.7±1.2)%、(29.4±0.9)%，随舒林酸浓度增加，凋亡率亦随之增加，其中0.5、1.0 mmol/L处理组与对照组的(6.5±0.3)%相比，差异无统计学意义(P值分别为0.792、0.288)，1.5、2.0 mmol/L组与对照组相比，差异有统计学意义(F值分别为189.432、164.400，P值均<0.05，图2)。

图2 对照组(a)及0.5、1.0、1.5、2.0 mmol/L舒林酸(b、c、d、e)处理48 h后PANC1细胞的凋亡

3．舒林酸对细胞β-catenin mRNA及蛋白表达的影响：PANC1细胞β-catenin mRNA表达量随着舒林酸浓度的增加而下调，对照组及0.5、1.0、1.5、2.0 mmol/L组的β-catenin mRNA表达量分别为1.00±0.03、0.96±0.03、0.92±0.04、0.52±0.09、0.35±0.09，0.5、1.0 mmol/L组与对照组的差异无统计学意义(P值分别为0.322、0.074)，而1.5、2.0 mmol/L组与对照组的差异具有统计学意义(P值均<0.05)。2.0 mmol/L舒林酸处理PANC1细胞12、24、48、72 h，细胞β-catenin mRNA表达量分别为0.44±0.02、0.30±0.05、0.16±0.01、0.16±0.04，随着处理时间延长而逐渐降低，均较对照组的0.60±0.02下调，差异有统计学意义(F=192.408，P<0.05，图3)。

细胞的β-catenin蛋白表达亦随着舒林酸浓度的增加逐渐降低，其中0.25、0.5 mmol/L处理组与对照组间的差异无统计学意义(P值分别为0.472、0.586)，而1.0、1.5、2.0 mmol/L处理组与对照组间的差异均有统计学意义(P值均<0.05，表2，图4)。

图3 0、0.5、1.0、1.5、2.0 mmol/L舒林酸(1、2、3、4、5)处理24 h后(a)及2.0 mmol/L舒林酸处理0、12、24、48、72 h(1、2、3、4、5)后(b)细胞β-Catenin mRNA的表达

表2 不同浓度舒林酸对人胰腺癌PANC1细胞β-catenin表达影响

图4 对照组(a)及0.25、0.5、1.0、1.5、2.0 mmol/L舒林酸(b～f)处理24 h后细胞β-catenin蛋白的表达(免疫组化 ×400)

讨论NSAIDs是常用的解热镇痛消炎药物，近年来研究证明NSAIDs还能对肿瘤有化学预防的作用，尤其是在结、直肠癌预防方面。Peter等对17 285名需要口服阿司匹林预防心血管疾病的患者平均随访6.5年，结果发现阿司匹林能降低肿瘤的远处转移，尤其是结直肠腺瘤的远处转移[8]。Stein等[9]应用舒林酸处理不同结肠癌细胞系，结果能降低细胞β-catenin的表达及核聚集，在动物体内实验中舒林酸能降低肿瘤的转移，其机制与β-catenin及其下游转录激活基因S100A4表达减少有关。他们认为舒林酸通过调节β-catenin信号通路具有抗肿瘤细胞转移的潜质。

本研究结果显示，舒林酸呈浓度依赖及时间性抑制PANC1细胞的增殖，诱导细胞的凋亡。但在药物处理48 h后的细胞增殖抑制效果不如48 h前明显，可能与药物消耗及细胞内β-catenin表达下降相关。RT-PCR及免疫细胞化学结果显示，经舒林酸处理后PANC1细胞的β-catenin mRNA及蛋白表达均明显下调，在1.5及2.0 mmol/L舒林酸处理后细胞基本不表达β-catenin蛋白，与舒林酸对肝癌细胞及结肠癌细胞的影响相似。

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