CELF1蛋白在神经胶质瘤组织中的表达及临床意义

吴斌 孙才兴 冯方 夏亮★

CELF1蛋白在神经胶质瘤组织中的表达及临床意义

吴斌 孙才兴 冯方 夏亮★

目的 探讨CELF1在脑胶质瘤中的表达及临床意义。方法 采用免疫组织化学技术及Western blot检测62例脑胶质瘤患者中CELF1的表达情况，分析CELF1蛋白表达及临床病理特征之间的关联。采用Kaplan-Meier法进行生存分析。结果 在脑胶质瘤中CELF1的表达上调，其表达上调与脑胶质瘤的恶性程度及预后明显相关。结论 CELF1可能成为胶质瘤的独立预后因素。

胶质瘤 CELF1 预后

神经胶质瘤是神经系统最常见的原发性恶性肿瘤之一，恶性胶质瘤约占原发性恶性脑肿瘤的70%［1］，尽管外科手术水平、放疗、化疗技术不断提高，但并未能显著改善脑胶质瘤患者的预后，患者的中位生存期一般为9～12个月［2］。因此，发现新的分子生物学标记物对确定胶质瘤的分子亚型和进行个体化治疗及判断预后具有重要意义。CELF1是CELF家族的成员之一，是一类发育调控的RNA结合蛋白质家族。然而，CELF1与脑胶质瘤的关系尚不清楚。本研究采用免疫组化染色和Western blot检测62例脑胶质瘤标本中CELF1蛋白的表达情况，并对其与临床病理参数和预后的关系进行统计学分析，探讨CELF1在脑胶质瘤发生、发展中的作用及临床意义。

1 临床资料

1.1 一般资料 选取本院2005年2月至2013年6月治疗并有完整随访资料的62例患者标本，所有患者术前均未接受过放化疗，其中男30例，女32例；年龄35～74岁，平均年龄53岁。低级别胶质瘤（WHO I～II级）25例，高级别胶质瘤（WHO III～IV级）37例。另有8例脑外伤患者行颅内减压手术切除的正常脑组织（NB）作为对照组。所有患者均行显微神经外科手术治疗，并获得明确病理诊断。术后高级别胶质瘤患者均行标准同步放化疗，放疗剂量54～60Gy，并给予STUPP方案替莫唑胺辅助化疗6个周期；低级别胶质瘤有高危因素的患者行术后放疗，放疗剂量45～54Gy。

1.2 主要材料与试剂 CELF1多克隆抗体（Abcom公司，美国），辣根过氧化物酶（HRP） 标记的驴抗山羊IgG（H+L）（南通碧云天生物技术研究所），生物素化鼠抗山羊IgG免疫组化试剂盒 （德国汉堡Dako公司生产），抗β- actin单克隆抗体（南通碧云天生物技术研究所），Trizol 购自 Invitrogen 公司；逆转录及半定量PCR 试剂盒购自Ferments公司；聚合过氧化物酶标记鼠抗山羊 IgG Western Blot 试剂盒 （南通碧云天生物技术研究所）。

1.3 方法 （1）免疫组织化学法：选取材料（5μm）制备载玻片，并用10%聚赖氨酸覆盖。用梯度乙醇溶液进行脱蜡，并且将切片浸泡在0.3%过氧化氢溶液中30min以阻断内源性过氧化物酶的活性。为了重新得到抗原，将切片置于10 mmol/L pH 6.0 的柠檬酸缓冲液中，并加热至121℃保持20min。PBS（pH7.2）冲洗以阻止任何非特异性反应，然后在室温下加入驴血清（10%）反应1h，再与山羊抗人CELF1多克隆抗体（1：100稀释；Abcam公司，美国）在4℃下一起温育过夜。根据过氧化物酶-抗过氧化物酶方法（Dako公司，德国）处理每个载玻片。PBS溶液冲洗后，将玻片与二氨基联苯胺四盐酸盐一起置于0.05mol/L pH7.6的Tris缓冲液进行孵育，该缓冲液中含有0.03%的过氧化氢，然后发生过氧化物酶反应。每个玻片都进行苏木染色，随后脱水并盖片。为了评估CELF1在不同分级肿瘤中的表达，每个玻片选取10个随机视野放大400倍进行检查，并用莱卡光学显微镜（ Wetzlar，德国）进行检测。每个标本随机选取5个高倍视野，并检测核染色。选择＞500个细胞 进行计数计算平均百分比，即染色细胞的百分比。如果核染色＞5%定义CELF1蛋白表达为阳性（胞浆染色不算）。如果核染色分别＜5%、5%～30%、30%～70% 或＞70%，蛋白表达分别定义为（-）、（+）、（++）或 （+++）。（2）蛋白质印迹法（Western blot）：提取总蛋白，并用牛血清白蛋白的方法检测蛋白浓度（碧云天生物技术研究所，南通）。每一个样品提取40μg蛋白质裂解物，以10%丙烯酰胺凝胶进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳，然后在350 mA下将其转移至聚偏二氟乙烯膜（Millipore公司，美国）反应2.5h。采用脱脂牛奶（5%）阻断反应膜，利用针对CELF1（1：500，Abcam公司，美国），CDKN1B （1：1000，Sigma，美国），caspase-3 （1：1000，Abcam公司，美国），裂解的 caspase-3 （1：1000，Abcam公司，美国） 或 β-肌动蛋白 （1：2000，碧云天生物技术研究所，南通）的第一抗体在4℃下一起孵育过夜。接着，加入HRP缀合的第二抗体（1：500，碧云天生物技术研究所，南通）进行温育。去除封闭液和抗体后，采用超增强化学发光（ECL，碧云天生物技术研究所，南通）的Western印迹检测试剂重新标记含有β-肌动蛋白的膜（1：2000，碧云天生物技术研究所，南通）。在ECL系统（碧云天生物技术研究所，南通）下观察蛋白质。每个蛋白条带都可由光密度进行量化，以柱状图表示。

1.4 统计学方法 采用SPSS17.0统计软件。计量资料以（±s）表示，组间比较采用t检验，计数资料采用χ2检验。采用Kaplan-Meier法和log-rank检验评估CELF1表达和患者生存的相关性。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 免疫组化 免疫组化结果表明CELF1蛋白定位于细胞核中，具有较高的表达（图1）。在神经胶质瘤组织中的总阳性率可达87.10%。在不同分级的神经胶质瘤中均可观察到由低至高的CELF1表达，而在正常脑组织中仅检测到3例CELF1弱阳性（+）表达。54例脑胶质瘤组织中检测到不同水平的CELF1阳性表达（+，++，+++）； 其中31例高级别脑胶质瘤中可检测到CELF1的阳性（++）或强阳性（+++）表达；低级别脑胶质瘤中有4例检测到CELF1的阳性（++）或强阳性（+++）表达。表明CELF1表达随着肿瘤等级的上升而增加。

2.2 Western blot 在不同分级的神经胶质瘤组织和正常脑组织中均检测出CELF1蛋白的表达。CELF在不同分级（I～IV）的胶质瘤组织中的表达（1.06±0.15）显著高于正常脑组织（0.36±0.08）（P＜0.01）。同时其表达在低等级胶质瘤组织（I～II）（0.83±0.11）和高等级（III～IV）胶质瘤组织（1.26±0.14）中差异有统计学意义（P＜0.05）。

2.3 CELF1表达与神经胶质瘤的临床病理特征之间的相关性 根据CELF1的表达谱，神经胶质瘤组织的表达水平可分为高表达（+++++）或低表达（+，-）。实验表明，CELF1表达水平与患者性别、年龄、肿瘤体积或起源部位之间无显著相关性（P＞0.05）。然而，CELF1的表达水平与肿瘤的病理分级具有显著相关性（P=0.002）。在患者的总生存方面，高表达组和低表达组之间差异有统计学意义（P=0.001）。比较于CELF1表达较低的患者，CELF1表达上调患者的总生存时间更短。因此，CELF1表达可能成为神经胶质瘤患者的独立预后因素。

图1 正常脑组织和不同分级的神经胶质瘤中CELF1免疫组化的代表性切片（×400）

3 讨论

目前的研究表明胶质瘤是由多个基因之间的相互作用引起的复杂疾病，涉及多种癌基因的激活和抑癌基因的失活［3］。CELF1是CELF家族的成员之一（CUGBP 和ETR样因子），是一类发育调控的RNA结合蛋白质家族，在人类基因组中，已经发现CELF1、CUGBP2、CELF3、CELF4、CELF5及CELF6等6个家族成员［4］。这些蛋白质的功能是多方面的，在哺乳动物细胞核中，CELF1至CELF6通过刺激非连续性外显子的保留或删除而调节一些mRNA［5］。此外还可通过RNA编辑酶而调节一些mRNA的编辑［6］。在细胞质中，通过结合靶向mRNA的特定序列而调节一些mRNA的翻译或降解前体的选择性剪接［7］。利用这些调节途径又进一步对机体的生物学功能产生广泛的影响。Timchenko LT等［8］于1996年首先在几个强直性肌营养不良症（DM）细胞系、HeLa细胞和正常患者成肌细胞系中分离出（CUG）n mRNA前体/mRNA结合蛋白，并利用其在体外特异性结合（CUG）8寡核苷酸的特性而从HeLa细胞中纯化2个蛋白质、CELF1和CUGBP2。CELF1是正常细胞中主要的（CUG）8结合活性蛋白，而CUG-BP2水平在DM细胞的细胞核内是升高的。这两种蛋白是一种异基因核内核糖核酸蛋白（hnRNP），hNab50的不同亚型，主要定位在细胞核，并且可能与体内多聚腺苷酸化RNA的降解相关联。myotonin蛋白激酶（Mt-PK）mRNA的（CUG）n重复区是CUGBP/hNab50的结合位点，并且能吸附该hnRNP到突变Mt-PK转录物上。

已有研究表明，CELF1可能影响胚胎发育包括心脏发育，骨骼和脂肪组织分化以及生殖细胞形成［9］。最近研究已经表明，CELF1在许多人类恶性肿瘤中均存在过度表达，例如非小细胞肺癌、肝癌、乳腺癌、结肠癌、前列腺癌、口腔癌、急性骨髓性白血病和急性B细胞淋巴瘤［10～15］。但CELF1在神经胶质瘤中发生、发展中的作用尚不清楚。

本研究通过免疫组化染色和Western blot证实了在不同分级的神经胶质瘤中均存在由低至高的CELF1表达，而在正常脑组织中仅检测到3例CELF1弱阳性（+）表达。表明在脑胶质瘤组织中存在CELF1的过表达，且CELF1的表达程度与脑胶质瘤患者的病理分级明显相关，而与年龄、性别、肿瘤部位、肿瘤大小、KPS评分无相关性，表明CELF1在脑胶质瘤的发生、发展中具有重要作用。在患者的总生存方面，CELF1高表达组和低表达组之间差异有统计学意义（P=0.001）。相比较于CELF1表达较低的患者，CELF1表达上调患者的总生存时间更短。提示CELF1可以作为脑胶质瘤患者一种可能的治疗靶点和一个有价值的预后因素。而CELF1在脑胶质瘤中表达上调的分子机制目前仍有待于进一步的研究。

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Objective To discuss the clinical significance of the expression of CELF1 in glioma. Methods We examined CELF1 expression in 62 glioma patients by immunohistochemistry and Western blot.Analysing the association between the expression of CELF1 protein and clinicopathological characteristics. Survival analyses were performed using the Kaplan-Meier method.Result Our results showed that CELF1 protein was frequently up-regulated in human glioma tissues. The expression level of this protein was positively correlated with glioma World Health Organisation grade and inversely correlated with patient survival （P＜ 0.05）.Conclusion CELF1 may be a novel independent prognostic predictor of survival for glioma patients

Glioma CELF1 Prognosis

310022 浙江省肿瘤医院神经外科