姜黄素对小鼠帕金森病模型行为学的影响

朱悦红 徐彬 李光璐 胡肖依 吴忧⋆

姜黄素对小鼠帕金森病模型行为学的影响

朱悦红 徐彬 李光璐 胡肖依 吴忧⋆

目的 探讨姜黄素对C57BL/6小鼠帕金森病模型行为学的影响及常用行为学测试的比较。方法 取30只C57BL/6雄性小鼠随机分成3组：MPTP模型组、姜黄素治疗组和正常对照组；模型组、姜黄素组采用1-甲基-4-苯基1，2，3，6-四氢吡啶（ MPTP）腹腔注射造模，正常对照组给予等量0.9%氯化钠注射液腹腔注射。姜黄素组予姜黄素腹腔注射，连续1周。各组小鼠在最后1次MPTP或0.9%氯化钠注射液注射后7d予行为学指标检测。结果 姜黄素能改善帕金森病模型小鼠行为学中旷场试验、悬挂试验等相关指标（P＜0.05）。对爬杆试验相关指标无明显改善作用。结论 姜黄素可改善帕金森病模型小鼠行为学变化。爬杆试验、悬挂试验较易受主观因素影响，旷场试验是更为客观的检测方法。

1-甲基-4-苯基1，2，3，6-四氢吡啶（MPTP） 帕金森病 姜黄素 行为学测试

帕金森病 （PD）是中老年人常见神经系统变性疾病之一，已严重威胁人类健康［1］。研究认为，路易小体（Lewy bodies）中异常聚集的α-突触核蛋白（α-Syn）与PD的发生发展密切相关［2，3］。α-Syn寡聚体的形成在PD的发病机制中发挥着关键作用［4～6］。姜黄素（curcumin）是一种多酚类物质，近年来其生物学活性受到广泛关注［7～9］。研究发现，姜黄素可能通过诱导自噬继而促进α-Syn的自噬性清除而发挥对PD的神经保护作用［10～12］。2015年6月至9月作者通过试验研究，探讨姜黄素治疗C57BL/6小鼠帕金森病模型运动障碍的疗效及常用行为学测试的比较。

1 材料和方法

1.1 材料 （1） 试验试剂：姜黄素、1-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氢吡啶（MPTP）购自Sigma公司。（2）试验动物：清洁级健康C57BL/6小鼠，8～10周龄，18～22g，雄性；饲养条件：清洁级环境中饲养，正压屏障系统，动物可自由摄食饮水，以上试验动物、设施、饲料等均由浙江中医药大学动物试验中心提供。

1.2 方法 （1）分组：将小鼠随机分为3组，即MPTP模型组（10只）、姜黄素治疗组（10只）和正常对照组（10只）。（2）MPTP小鼠PD模型建立：MPTP和姜黄素治疗组予MPTP腹腔注射30mg/（kg·d），1次/d，一共注射7d，建立亚急性PD模型。正常对照组予腹腔注射0.9%氯化钠注射液20ml/（kg·d），1次/d，连续7d。（3）姜黄素处理：姜黄素治疗组在MPTP腹腔注射的同时予姜黄素（80mg/Kg）腹腔注射，1次/d。（4）行为学检测：各组小鼠在最后1次MPTP 或0.9%氯化钠注射液注射后7d进行行为学指标测试。

1.3 行为学测定指标及方法 （1）一般状态观察：观察小鼠的精神状态、姿势、皮毛色泽、活动度等全身情况。（2）爬杆试验（Pole test）：按文献方法［13］制作一长60cm、粗0.8cm光滑不锈钢杆，杆上缠上纱布以防滑，并将一大小适中的软木球固定于杆顶端。将小鼠放至小球上，测定并记录小鼠整个爬杆时间，每只小鼠测定3次，间隔30 min/次，取平均值［14］。试验开始前对其进行爬杆训练，无法练习者予以剔除。（3）悬挂试验 （ Traction test ）：根据Wang W等［15］的试验方法将小鼠的前爪悬挂在一条水平电线上。小鼠若两只后肢均能抓住电线记为3分，一只后肢能抓住电线记为2分，两只后肢均不能抓住电线记为1分，计算每只小鼠得分情况。试验开始前对其进行悬挂训练，无法练习者予以剔除。（4）旷场试验（OFT ）：将试验小鼠放在1个长宽均为80cm、高40cm、四壁底面为黑色，底面为白线划分为面积相等的25块立方形敞箱的安静环境中，顶部中央安置摄像机。沿墙格为外周区域，其余为中央区域。在进行旷场试验前，先将各组小鼠放置于测试试验室内适应环境10min，随后试验操作者将小鼠轻放入旷场箱的中央区内，开始同步计时录像，每只试验小鼠测定1次，测定时间为15min。记录小鼠的平均速度及运动总距离。试验均于上午9～12点进行［16］，试验前彻底清理上次试验留下的小鼠粪便、尿液等。

1.4 统计学方法 采用SPSS17.0统计软件。计量资料用（±s）表示，组间比较采用单因素方差分析（one-way ANOVA），以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 一般形态观察结果 造模前各组小鼠毛色、进食等方面均无明显差异。造模结束后模型组小鼠逐步变为倦怠、毛发枯黄散乱、烦躁、易激惹、震颤、运动减少、步态不稳、竖尾竖毛等表现；与模型组比较，姜黄素组毛色有明显好转，进食可，活动频率增加。

2.2 爬杆试验 C57BL/6小鼠在爬杆试验中能够迅速转向并爬到底端，则耗时越短，表明运动和协调能力越强。结果MPTP模型组、姜黄素组爬杆时间与正常对照组比较显著延长（P＜0.01），模型组及治疗组未见差异。见表1。

2.3 悬挂试验 将C57BL/6小鼠后爪抓住电线的情况，按照评分标准进行评分。分值越高，小鼠抓住电线越牢固，表明小鼠肢体运动协调情况越好；反之，则表明小鼠震颤、肌强直等情况严重。结果MPTP模型组、姜黄素治疗组与正常对照组的分值比较差异有统计学意义（P＜0.01）。姜黄素治疗组与MPTP模型组分值比较差异有统计学意义（P＜0.05）。见表1。

2.4 旷场试验 正常对照组在旷场试验15min活动总距离及行动平均速度均明显大于MPTP模型组和姜黄素治疗组（P＜0.01），但姜黄素组与MPTP模型组比较，15min活动总距离及平均速度明显改善（P＜0.01）。见表1。小鼠旷场试验活动轨迹：正常对照组活动的范围和量远高于模型组及治疗组，但姜黄素组相对于MPTP模型组，活动的范围和量明显提高，进入中央区域的次数增多。见图1。

图1 各组大鼠矿场试验活动轨迹

表1 各组小鼠行为学试验结果比较（±s）

表1 各组小鼠行为学试验结果比较（±s）

注：与正常对照组比较，*P＜0.05，**P＜0.01；与模型组比较，△P＜0.05，△△P＜0.01。

组别爬杆时间（s）悬挂试验分值旷场试验结果活动总距离（cm）平均速度（cm/s）姜黄素治疗组14.36±0.45*2.3±0.67*△15823.8±987.8**△△17.58±1.09**△△MPTP模型组14.86±0.51*1.5±0. 53**13885.2±987.3**15.43±0.34**正常对照组12.09±0.313.0±0.0019964.7±1581.322.18±1.76

3 讨论

运动障碍是帕金森病患者的主要临床表现之一，主要表现为静止性震颤、运动减少、运动困难和运动协调能力降低。C57BL/6小鼠在注射MPTP后，可以产生与临床PD患者十分相似的病理及生化改变，明显诱导出帕金森病的症状［16］。试验结果显示，在经过1周的造模后，模型组小鼠普遍出现震颤、运动减少、步态不稳、竖尾竖毛等表现，表明MPTP造模小鼠符合帕金森运动障碍表现。姜黄素组一般状况明显好转，表明姜黄素起到干预调节的作用。

爬杆试验是帕金森病模型小鼠运动功能检测中十分常用的方法之一，具有便捷、易操作的特点而被广泛使用。本资料显示，模型组及治疗组爬杆时间差异无统计学意义。因MPTP损伤使小鼠四肢震颤、运动不协调出现不能抓杆甚至直接落地的现象。部分小鼠在试验中缺乏爬下杆的趋势，因而导致爬杆时间非正常延长，影响试验结果准确性。且爬杆法容易受主观因素（如试验人员的不同）影响，不易进行客观评分［17］。

悬挂试验主要用于测试小鼠四肢抓力及协调能力，操作性强，评分较客观。本资料显示，MPTP模型组、姜黄素治疗组与正常对照组的分值比较差异有统计学意义，表明姜黄素可改善帕金森小鼠模型运动协调能力。但悬挂试验极易受个体差异影响，需要扩大样本量才能提高试验的可靠性。

旷场试验是评价小鼠在新异环境中自主行为、探究行为与紧张度的一种常用方法，操作简便，方法可靠，且高效客观［18］。特别是计算机技术和相应图像处理技术的引入，使动物行为分析的检测指标大为增加［19］。本资料中，MPTP模型组15min运动总长度及平均速度比正常对照组减少，进入中央区域的次数减少，表明小鼠自主活动能力和探究能力明显下降。但姜黄素组情况较之有明显好转，表明姜黄素能改善小鼠上述行为改变。

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Objective To observe the curative effect of Curcumin on C57BL/6 mice behavioral manifestation in PD models，and to compare three behavioral tests which are often used in PD models. Methods 30 C57BL/6 mice were randomly divided into three groups as control group，MPTP+Curcumin group and model group. Mice in MPTP+Curcumin group and model group received intraperitoneal injection with MPTP to establish PD models，and mice in control group received intraperitoneal injection with the same amount of saline solution for 1 week. Mice in MPTP+Curcumin group received intraperitoneal injection with Curcumin the same time. Animal behavior detections were carried out on the 7th day after injection. Results Curcumin could improve the general condition and behavioral manifestation in open fi eld test and traction test （P＜0.05），while the effect on pole test was not signifi cant. Conclusions This study for behaviors of mice in the three groups further confi rmed that Curcumin could treat PD model mice behavior to some degree. Subjective factor was inclined to be involved in pole test and traction test. Open fi eld test is a more objective ethological method for MPTP model mice of Parkinson's disease.

1-methyl-4-phenyl-1，2，3，6-tetrahydropyridine（MPTP） Parkinson's disease Curcumin Behavioral test

浙江省中医药青年人才基金项目（No. 2015ZQ017）

310053 浙江中医药大学（朱悦红 李光璐 胡肖依）

310005 浙江中医药大学附属第二医院 （徐彬 吴忧）