蛹虫草多糖的亚临界水萃取及其抗氧化活性研究

杨文雅,李长征,张海晖,张　迪,蔡梅红,王　佳,段玉清

(江苏大学 食品与生物工程学院,江苏镇江 212000)



蛹虫草多糖的亚临界水萃取及其抗氧化活性研究

杨文雅,李长征,张海晖,张迪,蔡梅红,王佳,段玉清*

(江苏大学 食品与生物工程学院,江苏镇江 212000)

以蛹虫草为原料,通过单因素和响应面分析实验对亚临界水提取蛹虫草多糖的工艺条件进行优化并对所得到的多糖进行结构鉴定和抗氧化活性测定。结果表明,优化得到的最佳提取条件为:pH为8,提取温度180 ℃,水料比为21∶1(mL/g),萃取时间为13 min时,萃取得率为7.13%,与传统热水浸提法相比,亚临界水浸提法在提取得率和提取时间方面均具有明显的优势(传统热水浸提法分别为1.72%,180 min)。传统热水浸提法和亚临界水浸提法得到的蛹虫草多糖均具有一定的还原能力,并且其DPPH·清除作用的IC50值分别为0.324、0.314 mg/mL。红外光谱分析表明热水浸提和亚临界水浸提得到的蛹虫草多糖具有相同的结构特征。

蛹虫草,多糖,亚临界水,抗氧化

亚临界水(Subcritical water extract,SWE)是指温度介于100～374 ℃之间,在一定压力下能维持液体状态的水[1-3],并且随着温度的升高,水的极性、表面张力和黏度都急剧下降,对中极性和非极性化合物的溶解能力会大大增加,其性质更接近于有机溶剂[4]。与现有的超临界CO2萃取技术相比,亚临界水萃取技术具有成本低廉,设备简单,可以选择性连续提取不同极性化合物及操作简便等优点[5],是一种具有潜力的绿色提取技术。目前,亚临界水萃取技术已在挥发油、多酚类物质、多糖、黄酮和花青素等有效成分的提取中得到了广泛应用[6],但蛹虫草多糖的亚临界水萃取尚未见报道。

蛹虫草(Cordyceps militaris)又称北冬虫夏草,蛹草菌,蛹草等。其中含有虫草酸、虫草素和虫草多糖以及超氧化物歧化酶等多种生物活性物质,具有抗氧化、增强免疫、抗炎、抗肿瘤以及延缓衰老等生理功效[7-8]。蛹虫草多糖(Cordyceps militaris polysacchaide,CMP)是蛹虫草中的重要的活性物质,具有抗肿瘤、抗氧化、增强免疫功能等作用,具有广阔的开发前景[9],在目前的研究中主要采用水提法和无水乙醇沉淀法相结合的方法提取蛹虫草多糖,并加以超声波辅助和微波辅助等方法来提高多糖的提取率,进行进一步的研究。

本文利用亚临界水萃取技术,研究蛹虫草多糖的萃取技术参数,确定最佳工艺,并对亚临界水萃取的蛹虫草多糖的抗氧化活性及其初级结构进行研究。以期解决传统热水浸提多糖溶出率低的技术问题。为蛹虫草资源的综合开发利用提供理论依据和参考。

1　材料与方法

1.1材料与仪器

蛹虫草干燥蛹虫草菌丝体由徐州鸿宇农业科技有限公司提供。

葡萄糖、浓硫酸、苯酚、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、氢氧化钠、无水乙醇、铁氰化钾、三氯乙酸、盐酸、三氯化铁、硫酸亚铁、过氧化氢等均为分析纯,购于上海国药集团化学试剂有限公司。

BS224S型电子天平Sartorius Germany;HH-S4数显恒温水浴锅江苏金坛市医疗仪器厂;GSH型亚临界水反应釜镇江丹徒环球机电配件厂;UV-265FW紫外可见分光光度计 Shimadzu Co. Japan;DL-5C离心机上海安亭有限公司;Avatar 360 FT-IR傅立叶变换红外光谱仪美国Nicolet公司。

1.2实验方法

1.2.1蛹虫草多糖的测定方法采用苯酚硫酸法[10]。准确称取标准葡萄糖10 mg于100 mL容量瓶中,加蒸馏水至刻度,分别吸取0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6 mL,各以水补至2.0 mL,然后加入6%苯酚(现配)1.0 mL及浓硫酸5.0 mL,静置10 min,摇匀,室温放置20 min以后于490 nm测吸光度,以2.0 mL蒸馏水按同样显色操作作为空白,以葡萄糖浓度为横坐标,吸光度值为纵坐标,进行线性回归得到标准曲线方程。

蛹虫草多糖的提取得率(%)=提取液中蛹虫草多糖的质量/蛹虫草菌丝体干粉的质量×100

1.2.2蛹虫草多糖中总多酚的测定采用Folin-clocalteau法[11],以没食子酸为标准品,配制成浓度梯度为12.5、25、50、100、150、200 μg/mL 6个样液,将Folin试剂取出一定体积稀释10倍,取该稀释液4 mL加入到1 mL样液中,然后加入5 mL 7.5%的碳酸钠溶液,25 ℃静置2 h后在765 nm测定吸光度,并以吸光度为纵坐标,没食子酸浓度为横坐标,得到总多酚含量的标准曲线方程。

1.2.3亚临界水萃取蛹虫草多糖的单因素实验以蛹虫草的多糖得率为实验指标,对影响多糖得率的pH(5.0、6.0、7.0、8.0、9.0)、温度(100、120、140、160、180 ℃)、浸提时间(4、8、12、16、20 min)、水料比(10∶1、20∶1、30∶1、40∶1 mL/g)4个因素进行单因素实验,并确定最佳的工艺参数。

1.2.4亚临界水萃取蛹虫草多糖的响应面分析实验参考以上单因素实验所得结果,选取釜液pH、提取温度、提取时间和水料比为四个考察因素,利用Box-Behnken方法,选取4个中心点进行29组实验,实验设计见表1。

表1　实验因素水平表Table 1　Table of factors and levels

1.2.5蛹虫草粗多糖提取工艺参照文献方法[12],在90 ℃,180 min,水料比20∶1 mL/g的条件下进行传统热水浸提。脱脂虫草粉末→热水浸提→离心→上清液→浓缩→乙醇沉淀→脱蛋白→透析→冷冻干燥→虫草多糖粗提物。

在最优工艺条件下进行亚临界水浸提。脱脂虫草粉末→亚临界水浸提→离心→上清液→浓缩→乙醇沉淀→脱蛋白→透析→冷冻干燥→虫草多糖粗提物。

1.2.6还原能力的测定参照文献方法[13],将两种蛹虫草多糖提取物配制成不同的质量浓度,取多糖溶液1 mL于试管中,分别加入2.5 mL磷酸盐缓冲溶液(pH6.6)和2.5 mL 1%的铁氰化钾溶液,摇匀,在50 ℃保温20 min后取出,快速冷却,加入2.5 mL 10%的三氯乙酸,混匀后离心(3000 r/min)10 min,取上清液2.5 mL,加入2.5 mL蒸馏水和0.5 mL 0.1%三氯化铁溶液,混匀后,在700 nm处测定吸光度。吸光度越大,表明样品还原能力越强。用蒸馏水作为空白对照。

1.2.7DPPH·清除率的测定参见文献[14],将两种蛹虫草多糖提取物配制成不同的质量浓度,取多糖溶液2 mL于试管中,加入2 mL DPPH·无水乙醇溶液(0.2 mmol/L),混匀后在室温下避光反应30 min,于517 nm处测定吸光度,记为Ax。空白组为2 mL无水乙醇代替DPPH溶液,加入2 mL多糖样品,在517 nm下测定吸光度,记为Ax0。对照组分别加入2 mL DPPH溶液,2 mL无水乙醇,在517 nm下测定吸光度,记为A0。对DPPH·清除率计算公式如下:

清除率(%)=[1-(Ax-Ax0)/A0]×100

1.2.8红外光谱扫描取少量热水及亚临界水萃取的粗多糖,与100～200 mg经干燥的KBr粉末在红外灯下于玛瑙研钵中轻轻研磨均匀。经压片机压成薄片,进行红外光谱测定。

2　结果与分析

2.1蛹虫草提取物中多糖和多酚的含量测定

2.1.1苯酚硫酸法测定总糖的标准曲线如图1所示,葡萄糖在0.00～60 μg范围内,其浓度与吸光度线性关系良好。经线性回归,标准曲线方程为A=0.00749C-0.01786(R2=0.9914)

式中:C-葡萄糖浓度((g/mL);A-吸光值(OD490)。

图1　总糖标准曲线Fig.1　The standard curve of total polysaccharide

2.1.2Folin-clocalteau法测定总多酚的标准曲线根据标准没食子酸的浓度及其对应的吸光值的关系,得到的总多酚浓度的标准曲线如图2,经线性回归,总多酚含量的标准曲线方程为:Y=0.0054C-0.0198(R2=0.9949),式中:C-没食子酸((g/mL);A-吸光值(OD765)说明没食子酸在此浓度范围内和吸光度线性关系良好。

图2　总多酚标准曲线Fig.2　The standard curve of total polyphenol

从标准曲线中计算得到蛹虫草提取物中多糖和多酚含量如表2所示。由表中可知,亚临界水浸提法得到的总糖和总酚含量均略高于热水浸提法,这与亚临界水本身的强溶解和强分解能力是分不开的,并且亚临界水提取可以在数分钟的短时间内完成,较传统热水提取法具有较高的效率。

表2　蛹虫草提取物中多糖和多酚含量Table 2　Polysaccharide and polyphenol content of cordyceps militaris extract

2.2单因素实验结果与分析

2.2.1pH对多糖得率的影响pH对多糖得率的影响如图3所示,虫草多糖的提取得率在pH变化的范围内随pH的增大先增大后减小,当pH=7时,提取得率达最大,并且过酸或者过碱都会对虫草多糖的稳定性产生影响,因此综合考虑选择pH7左右为宜。

图3　pH对多糖得率的影响Fig.3　Influence of pH on the yield of polysaccharide

2.2.2温度对多糖得率的影响温度对多糖得率的影响如图4所示,在温度变化范围内随提取温度的升高,虫草多糖的提取得率先增加后减小,分析认为温度过高,不利于多糖的提取,而且温度太高会破坏多糖的结构并致使多糖分解或有其它物质溶出,从而导致提取得率的降低,而温度过低时,浸提不完全[15],因此从得率和节能方面综合考虑选择最适提取温度为160 ℃。

图4　提取温度对多糖得率的影响Fig.4　Influence of extracting temperature on the yield of polysaccharide

2.2.3浸提时间对多糖得率的影响浸提时间对多糖得率的影响如图5所示,在提取时间达到12 min之前,多糖的提取得率随着时间的延长而提高,但再增加时间,多糖的提取得率有所下降,可能是因为多糖在水中浸提时间过长,破坏它的结构,导致多糖含量减少,综合考虑选取提取时间12 min左右为宜。

图5　提取时间对多糖得率的影响Fig.5　Influence of extracting time on the yield of polysaccharide

2.2.4水料比对多糖得率的影响水料比对多糖得率的影响如图6所示,随着水料比的增加,虫草多糖的提取得率先增大后减小,当达到30∶1(mL/g)时,虫草多糖的提取得率最大。在提取过程中若水料比太小,提取不完全,水料比过大,会降低了提取液中固形物的含量,不利于后续操作。综合虫草多糖提取得率考虑,选择水料比为30∶1(mL/g)左右为宜。

图6　水料比对多糖得率的影响Fig.6　Influence of water-to-material ratio on the yield of polysaccharide

2.3响应面实验结果和方差分析

在单因素实验结果的基础上,利用Box-Behnken对影响蛹虫草多糖亚临界水提取效果的因素进行响应面分析实验,并对实验结果进行统计分析,结果如表3。

表3　响应面分析方案及结果Table 3　Scheme and results of response surface analysis

表4　回归模型方差分析Table 4　Analysis of variance for the fitted regression model

以蛹虫草多糖提取率为响应值(Y),通过Design-Expert 7.1.3统计软件对实验结果进行回归分析,并剔除不显著项,得到的回归方程简化为:

Y=4.92+0.41X2-0.52X1X3-0.50X1X4-0.77X2X3-0.70X2X4-0.67X3X4+1.01X22-0.44X32+0.42X42。

对此回归模型进行方差分析,结果如表4所示。从表4中可知,该模型的F=22.66,p<0.0001,高度显著;失拟项p=0.6855>0.05,说明失拟项相对于误差项不显著;决定系数R2=0.9577,说明该模型的拟合性较好,可用此模型来分析和预测多糖亚临界水提取的工艺参数。由表5可知,一次项X2,交互作用项X1X3、X1X4对蛹虫草多糖提取率影响显著,二次项X22、X32、X42,交互作用项X2X3、X2X4、X3X4对多糖提取率影响极显著,通过对各影响因素进行F值检验,得到因素之间贡献作用依次是温度(X2)>萃取时间(X1)>pH(X3)>水料比(X4)。

通过响应面分析得出最佳提取条件为:提取溶液pH为7.87,提取温度179.37 ℃,水料比为20.61∶1(mL/g),萃取时间为13.11 min。在此条件下,蛹虫草提取得率理论值可达7.71%。考虑到实际操作,将多糖提取条件修正为pH为8,提取温度180 ℃,水料比为21∶1(mL/g),萃取时间为13 min,实际测得蛹虫草多糖得率为7.13%。因此,采用RSA法优化得到的提取工艺参数准确可靠,具有实用价值。然而,普通热水提取多糖的得率只有1.72%。

2.4蛹虫草多糖还原能力测定

还原力的测定是用来评价抗氧化剂活性的常用方法,可通过测定还原力的大小来说明其抗氧化活性的大小[16]。从图7以看出,在浓度为0.6～1.5 mg/mL范围内,还原能力均随浓度的增加而增大,与同浓度的VC相比,蛹虫草多糖所表现出的还原力相对较弱。从图中还可以看出两种方法浸提得到的多糖还原能力相当,这可能是由于两种多糖提取物中总酚及总糖含量相当,且有研究表明多糖的还原能力与其中含有的酚类物质含量有关[17],螯合了较多的金属离子,从而影响了粗多糖的还原能力。

表5　回归系数的显著性检验Table 5　Significance test of each regression coefficient

图7　还原能力的测定Fig.7　Effect of reduction capacity

注:*显著性水平5%;**显著性水平1%。

2.5蛹虫草多糖对DPPH·的清除

DPPH·是一种比较稳定,可以长时间保存的有机物自由基,广泛被用来测定纯抗氧化剂或植物提取物的体外抗氧化活性。从图8可以看出,VC与蛹虫草多糖均具有良好的DPPH·清除能力,在0.2～1.0 mg/mL范围内其对DPPH·的清除能力随浓度的升高而增强,当浓度为1.0 mg/mL时,VC的清除能力是98.8%,热水和亚临界水多糖的清除率分别为84.23%和85.02%,较VC的弱。且亚临界水提取的多糖清除能力略高于热水提取的多糖,其IC50值分别为0.314和0.324 mg/mL,可能是由于亚临界水处理使高分子量的多糖断裂,产生较多的羟基基团以提供与DPPH·孤对电子配对的质子,进而影响了对自由基的清除能力[18]。

图8　DPPH·的清除Fig.8　Effect of elminating DPPH

2.6红外光谱分析

根据糖类化合物在红外光谱图上呈现的特殊吸收,可以判断单糖类型,糖苷键连接方式及其功能基团等[19]。图9是两种多糖的红外光谱图,在3600～3200,3000～2800,1400～1200和1200～1000 cm-1区域之间是多糖的特征吸收峰,其中3300 cm-1左右处强而大的吸收峰是O-H的伸缩震动引起的,2900 cm-1及1400 cm-1处弱而小的峰分别是C-H的伸缩震动及弯曲震动引起的[20-21],在1650 cm-1左右的强吸收是糖分子中结合水的吸收,在1080 cm-1左右区域的比较大的吸收峰是由两种C-O伸缩振动引起的,其中一种属于C-O-H,另一种则属于糖环的C-O-C[22],在350～600 cm-1之间区域是吡喃糖环的特征吸收峰[23],从两种多糖的红外图谱可以推测出两者是吡喃型糖类,并且在结构上没有明显差异,因此,经亚临界水处理后,多糖的结构并未受到影响。

图9　两种蛹虫草多糖红外光谱分析图Fig.9　Infrared spectrum of two kinds of cordyceps militaris polysaccharide注:A:热水浸提蛹虫草多糖;B:亚临界水浸提蛹虫草多糖。

3　结论

通过单因素和响应面分析实验得到的亚临界水萃取蛹虫草多糖的最佳工艺参数是:pH为8,提取温度180 ℃,水料比为21∶1(mL/g),萃取时间为13 min,多糖得率为7.13%。与热水浸提法提取多糖相比,亚临界水具有省时节能、产率高的优点,这些优点是因为亚临界水本身具有的强溶解和强分解能力。对传统热水浸提和亚临界水浸提得到的两种多糖进行抗氧化活性实验表明两种多糖都具有一定的还原能力,其DPPH·清除作用的IC50值分别为0.324、0.314 mg/mL。对两种多糖的红外光谱分析表明,亚临界水处理并未对多糖的结构产生影响,且均具有多糖的特征吸收峰。

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Study on the optimization for the extraction and antioxidant activity of polysaccharide from cordyceps militaris by subcritical water

YANG Wen-ya,LI Chang-zheng,ZHANG Hai-hui,ZHANG Di,CAI Mei-hong,WANG Jia,DUAN Yu-qing*

(School of Food and Biological Engineering,Jiangsu University,Zhenjiang 212000,China)

The extraction condition of polysaccharide from cordyceps militaris by subcritical water was optimized using the single factor and response surface methodology and composition analysis and determination of antioxidant activity of polysaccharide from cordyceps militaris were studied. The results showed that the optimum extraction parameters obtained from response surface analysis were as follows:the ratio of polysaccharide in the extracts was 7.13% at pH value 8,180 ℃ for 13 min with the liquid-solid ratio of 21∶1(mL/g). Compared with the traditional hot water extraction,subcritical water extracting polysaccharide from cordyceps militaris had obvious advantage in saving time,extraction ratio(the methods of alkaline water was 7.13%,180 min). Cordyceps militaris polysaccharide by traditional hot water extraction and subcritical water extraction had certain reducing power and the role of the DPPH· clearing IC50value concentration were 0.324 mg/mL and 0.314 mg/mL.Infrared spectrometry analysis showed that polysaccharide from cordyceps militaris by hot water extraction and subcritical water extraction had the same structure features.

cordyceps militaris;polysaccharide;subcritical water;antioxidant

2015-07-15

杨文雅(1988-)，女，硕士研究生，研究方向:食品营养，E-mail:478451588@qq.com。

段玉清(1973-)，女，博士，教授，研究方向：食品营养，E-mail:dyq101@ujs.edu.cn。

国家自然科学基金(31201346)。

TS201.2

B

1002-0306(2016)05-0252-06

10.13386/j.issn1002-0306.2016.05.041