酸降解法制备褐藻寡糖抗氧化性的研究

2016-09-10 05:52胡博旸韭泽悟殷丽君李茉莉程永强
食品工业科技 2016年10期
关键词:糖醛酸肌肽褐藻

胡博旸,聂 莹,孙 路,韭泽悟,殷丽君,周 辉,李茉莉,程永强,*

(1.湖南农业大学,生物科学技术学院,湖南长沙 410128; 2.中国农业科学院农产品加工研究所,农业部农产品加工综合性重点实验室,北京 100193; 3.中国农业大学食品科学与营养工程学院,植物源功能食品北京市重点实验室,北京 100083; 4.日本国际农林水产业研究中心,日本筑波 305-8686; 5.湖南农业大学,食品科学技术学院,湖南长沙 410128)



酸降解法制备褐藻寡糖抗氧化性的研究

胡博旸1,聂莹2,孙路3,韭泽悟4,殷丽君3,周辉5,李茉莉1,程永强3,*

(1.湖南农业大学,生物科学技术学院,湖南长沙 410128; 2.中国农业科学院农产品加工研究所,农业部农产品加工综合性重点实验室,北京 100193; 3.中国农业大学食品科学与营养工程学院,植物源功能食品北京市重点实验室,北京 100083; 4.日本国际农林水产业研究中心,日本筑波 305-8686; 5.湖南农业大学,食品科学技术学院,湖南长沙 410128)

从褐藻胶中提取出聚甘露糖醛酸和聚古罗糖醛酸,利用盐酸降解聚甘露糖醛酸和聚古罗糖醛酸1、2、6 h分别制备了甘露糖醛酸组分(M1、M2和M3)以及古罗糖醛酸组分(G1、G2和G3),并且以肌肽和甘露糖为对照评估寡糖对DPPH自由基、超氧自由基和羟自由基的清除作用。结果表明,甘露糖醛酸以及古罗糖醛酸对DPPH自由基、超氧自由基具有良好的清除作用,且清除作用随着寡糖中还原糖含量的增加而增加。在DPPH体系中,M3的清除效果要好于肌肽,G3的清除效果与肌肽相近。在超氧自由基体系中,M3的清除作用高于M2和M1,而G3的清除作用略低于肌肽。在羟自由基体系中,甘露糖醛酸和古罗糖醛酸的清除效果低于肌肽和甘露醇。实验表明,酸法制备的褐藻寡糖具有较强的抗氧化能力,且抗氧化效果与寡糖的平均聚合度含量有关。

抗氧化,酸解,褐藻酸钠,褐藻寡糖

生物体在进行生命活动过程中会产生氧自由基,在人体内氧自由基的含量被一些酶如超氧化物歧化酶以及抗氧化物所控制。然而,过量的氧自由基会对细胞造成损伤,同时会使蛋白质损伤、酶失活、DNA损伤以及脂质过氧化等[1]。而氧自由基的累积和动脉粥样硬化、血栓的形成、糖尿病、肝炎和癌症等疾病有很大的关联[2-3]。抗氧化剂具有清除体内多种氧自由基的作用,因此探究活性物质的抗氧化性以及效率,对于预防多种疾病具有重要意义。

褐藻胶是由β-D-甘露糖醛酸(M)和α-L-古洛糖醛酸(G)通过1,4-糖苷键连接的线性水溶性酸性多糖[4]。而褐藻寡糖是褐藻胶的寡聚物,研究表明褐藻寡糖是一种具有多重功能性的活性寡糖,例如促进植物生长[5]、保护神经元[6]、增强免疫功能[7]、抗肿瘤[8]等,但是对于褐藻寡糖在体外抗氧化方面的研究仅是在近几年才逐渐有所报道。如Sen[9]从寡糖分子量大小,G/M比值不同两个角度探讨了褐藻寡糖对DPPH自由基的清除效果;孙丽萍[10]对三种不同分子量的褐藻寡糖混合物在清除超氧阴离子,羟自由基和次氯酸三种自由基方面进行了研究。上述研究基于酶法制备褐藻寡糖,酶解制备寡糖主要是通过催化1,4-糖苷键发生β-消除,在C-4和C-5位形成双键,从而形成不饱和的寡聚糖醛酸寡糖,酸降解法则是通过非选择性的断裂分子间的糖苷键,所得寡糖保留了褐藻胶的大分子结构,形成饱和的寡糖产物。本文主要是通过酸法制备褐藻寡糖,通过pH分级对两种糖醛酸进行完全的分离,探讨两种寡聚糖醛酸混合物对自由基的清除能力,发现了其在抗氧化性方面的独特功效,对于未来的生物制药及保健品开发提供科学支撑。

1 材料与方法

1.1材料与仪器

1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)、三羟甲基氨基甲烷(Tris)、D-葡萄糖醛酸、肌肽Sigma公司;褐藻胶西陇化工股份有限公司;甘露醇郑州博研生物科技有限公司;其他试剂为市售分析纯,均购自国药集团化学试剂北京有限公司。

T6紫外分光光度计北京普析通用仪器有限公司;Model 550酶标仪美国BIO-RAD公司;XMT数显调节水浴锅余姚长江温度仪表厂;S21-1恒温磁力搅拌器上海司乐仪器有限公司;PB-10 PH计德国哥根廷Sartorius公司。

1.2实验方法

1.2.1酸降解法制备褐藻寡糖按照Haug[11]的方法略有改变,将褐藻胶用蒸馏水配制成3%(w/v)的胶体溶液,电动搅拌机搅拌10 h使其充分溶胀。在胶体溶液中缓慢加入一定量的浓盐酸,使溶液中的盐酸浓度为0.5 mol/L。

溶液在90 ℃下反应10 h,然后离心(转速8000 r/min,5 min)取沉淀。沉淀用8%(w/w)的NaHCO3溶液溶解,在溶解液中缓慢加入0.3 mol/L的盐酸调节pH至2.85±0.01,静置分层,得黄色上清液及沉淀。上清液部分加入3倍体积95%乙醇,待白色沉淀析出,抽滤取沉淀,沉淀即为粗聚甘露糖醛酸(PM)。将沉淀与上清液分离,在沉淀中加入0.5 mol/L的盐酸后重复上述操作2~3次获得纯度较高的PM。

沉淀部分(PM)加水至6%(w/v),用10%(w/v)的NaOH的调解pH至7.0~8.0,过滤溶液除去部分杂质。滤液调pH至2.85±0.01,回收沉淀。沉淀即为粗聚古罗糖醛酸(PG),重复上述操作2~3次获得纯度较高的PG。

1.2.2酸降解PM片段和酸降解PG片段的制备按照张洪荣[12]的方法,将PM和PG分别配制成1%(w/v)的水溶液,并分别将溶液pH调至4.0和3.8。然后将溶液置于120 ℃的油浴锅中,分别反应1、2、6 h,以制备三组还原糖含量有显著差异性的褐藻寡糖组分,6 h后其反应所得还原糖含量与6 h时几乎无明显差异。将反应后的水解液冷却至室温,用0.5 mol/L NaOH溶液将其pH范围调至7.0~8.0。并将反应液中放入1%(m/v)的活性炭,在60 ℃水浴锅中搅拌30 min后过滤,将滤液冷冻干燥得样品粉末,分别称为M1、M2、M3;G1、G2、G3。

1.2.3还原糖含量测定采用DNS法[13]分别测定PM、M1、M2、M3、PG、G1、G2、G3的还原糖含量并与同浓度的肌肽对比(以下实验均为3次平行实验)

1.2.4褐藻寡糖对DPPH自由基的清除作用分别吸取10、20、30、40 mg/mL的M1的样品100 μL于酶标板样品孔中,再用连续加液器快速在各样品孔中加入50 μL 200 μmol/L的DPPH溶液,避光反应20 min后,用酶标仪在波长517 nm下测定吸光值A1,以100 μL的蒸馏水代替样品的空白组吸光值A0,根据以下公式计算清除率。同样方法测定M2、M3、G1、G2、G3的清除率。以肌肽作为对照。

式(1)

1.2.6褐藻寡糖对羟自由基(·OH)的清除作用采用Fenton反应体系,按照表1将溶液添加进试管,混匀在37 ℃水浴锅中水浴30 min,在波长520 nm下测定吸光值,根据式(2)求出清除率。以肌肽和甘露醇作为对照。

表1 羟自由基清除率测定方法

式(2)

其中:A1-样品管的吸光值;A2-样品参照管的吸光值;A3-损伤管的吸光值;A4-未损伤管的吸光值;A0-空白管的吸光值。

1.3数据处理

实验结果均为3次重复操作的均值,统计分析均应用SPSS(version20,IBMSoftware,Inc.)处理。显著性差异分析采用Duncan多重比较,当p<0.05时,认为差异显著。应用Origin8.5(OriginLab,Inc.)绘图。

2 结果与讨论

2.1测定不同降解时间的褐藻酸降解物中还原糖的含量

将酸解得到的甘露糖醛酸和古罗糖醛酸配制成1.0mg/mL的溶液,测定还原糖的含量,结果如图1和图2所示。结果表明,酸解0、1、2、6h后得到的PM、M1、M2、M3及PG、G1、G2、G3的还原糖含量有显著差异,而酸解6h以上的甘露糖醛酸和古罗糖醛酸的还原糖含量与酸解6h得到的甘露糖醛酸和古罗糖醛酸的还原糖含量差异不明显(因其非本研究重点,结果未显示)。

图1 不同酸降解时间的聚甘露糖醛酸样品中的还原糖含量Fig.1 The concentration of reducing sugar from the hydrolysis of Polymannuronates by different reaction time periods

图2 不同酸降解时间的聚古罗糖醛酸样品中的还原糖含量Fig.2 The concentration of reducing sugar from the hydrolysis of Polyguluronates by different reaction time periods

由图1和图2可以看出,酸解1、2、6 h后的反应液中还原糖含量依次显著增加(p<0.05)。多糖一般是由许多单体相互连接而成,无法形成具有还原性的糖分子或者还原性很弱。所以还原糖含量的增加,说明溶液中总糖的平均聚合度在逐渐地降低。本次研究选取还原糖含量具有明显差异的样品G1、G2、G3,对褐藻胶酸降解物进行还原糖含量与抗氧化性之间关系的研究,间接探究寡糖分子平均聚合度与其抗氧化能力的关系。

2.2褐藻胶酸降解物还原糖的含量与清除DPPH自由基能力之间的关系

测定甘露糖醛酸组分(M1、M2和M3)以及聚古罗糖醛酸组分(G1、G2和G3)对DPPH自由基清除能力并与同浓度的肌肽对比,结果如图3和图4所示。

图3 不同还原糖含量的聚甘露糖醛酸样品对DPPH自由基的清除作用Fig.3 Inhibitory rate on DPPH radicals by M1,M2,M3,carnosine

图4 不同还原糖含量的聚古洛糖醛酸样品对DPPH自由基的清除作用Fig.4 Inhibitory rate on DPPH radicals by G1,G2,G3,carnosine

从图3和图4中可以看出随着各个样品浓度的增加,聚古罗糖醛酸和聚甘露糖醛酸清除DPPH的能力逐渐加强。此外,随着还原糖量的增加,两种糖醛酸对于DPPH的清除能力不断提高。本实验选择肌肽作为参对照,肌肽是一种由β-丙氨酸和组氨酸组成的二肽,是一种天然的、食品工业中常用的抗氧化剂[14]。从图3中可以看出降解6 h的聚甘露糖醛酸M3对DPPH·的清除率要高于肌肽,而降解6 h的聚古罗糖醛酸G3对DPPH·的清除率低于肌肽,但相差不大。结合还原糖测定结果(图1、图2),发现还原糖含量高的褐藻寡糖的DPPH自由基清除作用较强。Sen[15]测定了辐照降解的褐藻寡糖对DPPH自由基的清除作用,研究表明,分子量越低的寡糖具有较高的清除作用,与本文研究结果一致。

图5 不同还原糖含量的聚甘露糖醛酸样品对超氧自由基的清除作用Fig.5 Inhibitory rate on superoxide radicals by M1,M2,M3,mannite,carnosine

图6 不同还原糖含量的聚古洛糖醛酸样品对超氧自由基的清除作用Fig.6 Inhibitory rate on superoxide radicals by G1,G2,G3,mannite,carnosine

从图5中可以看出,在M1、M2和M3三种还原糖量逐渐增加的聚甘露糖醛酸样品中,M3对超氧自由基的清除作用高于M1和M2。但是M1和M2对超氧自由基的抑制作用差距不大,反而还原糖量稍低的M1的抑制作用稍高于M2,这可能是由于超氧自由基的抑制对于还原糖的含量要求较高,还原糖浓度较低时抑制作用不明显。从图6中可以看出,三种古罗糖醛酸随着浓度的增加,对超氧自由基的抑制能力均逐渐提高。同时随着还原糖量的增加,对超氧自由基的抑制能力也逐渐增加。但是G3在20 mg/mL的抑制率却低于G1和G2,由于实验室条件受限,目前尚不能对此现象进行准确解释。

从图5、图6来看,聚古罗糖醛酸和聚甘露糖醛酸对超氧自由基的抑制能力,低于肌肽,高于甘露醇,而且聚古罗糖醛酸在相同浓度下要稍高于聚甘露糖醛酸。这与Ueno[16]的结果相符,Ueno通过酸法制备了平均聚合度在20~24的,发现两者对于超氧自由基的均具有明显的抑制作用并与样品的浓度有关,而且聚甘露糖醛酸的清除能力高于聚古罗糖醛酸。

2.4褐藻胶酸降解物还原糖的含量与清除羟自由基(·OH)能力之间的关系

测定甘露糖醛酸(M1、M2和M3)以及聚古罗糖醛酸(G1、G2和G3)对羟自由基(·OH)的清除率,结果如图7和图8所示。

图7 不同还原糖含量的聚甘露糖醛酸样品对羟自由基的清除作用Fig.7 Inhibitory rate on hydroxyl radicals by M1,M2,M3,mannite,carnosine

图8 不同还原糖含量的聚古罗糖醛酸样品对羟自由基的清除作用Fig.8 Inhibitory rate on hydroxyl radicals by G1,G2,G3,mannite,carnosine

3 结论

对于聚古罗糖醛酸和聚甘露糖醛酸,因为多糖还原性较低,通过还原糖的含量可以间接的表明样品的平均聚合度,从而探究不同聚合度的寡糖抗氧化能力。随着降解时间的延长,聚古罗糖醛酸和聚甘露糖醛酸的平均聚合度越低。

在聚古罗糖醛酸和聚甘露糖醛酸对于DPPH,自由基、超氧自由基和羟自由基的抑制实验中,基本符合随着两种糖醛酸的浓度上升,三种自由基的清除作用逐渐增强;以及随着两种糖醛酸的平均聚合度的降低,三种自由基的清除作用逐渐增强的规律。但是在聚甘露糖醛酸对于羟自由基的抑制实验中,所得到的实验结果与规律不符合,同时聚古罗糖醛酸和聚甘露糖醛酸对于羟自由基的抑制在较低浓度下不明显,即对于羟自由基的抑制作用,还原糖的最低限比较高,这可能是聚甘露糖醛酸对于羟自由基的抑制规律不明显的可能原因,有待于进一步验证。

通过对褐藻寡聚糖抗氧化性的研究,发现了其在抗氧化性方面的独特功效,对于未来的生物制药及保健品生产具有一定的辅助功效,而褐藻类海洋生物的巨大产量则是其量产化的重要保障,因此对于褐藻寡聚糖的研究将成为其重点研究方向之一。

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Antioxidant evaluation of alginate oligosaccharides prepared by acid hydrolysis with different conditions

HU Bo-yang1,NIE Ying2,SUN Lu3,NIRASAWA Satoru4,YIN Li-jun3, ZHOU Hui5,LI Mo-li1,CHENG Yong-qiang3,*

(1.College of Bioscience and Biotechnology,Hunan Agricultural University,Changsha 410128,China; 2.Institute of Agro-Products Processing Science and Technology CAAS,Key Laboratory of Agro-Products Processing,Ministry of Agriculture,Beijing 100193,China; 3.Beijing Key Laboratory of Functional Food from Plant Resources,College of Food Science and Nutritional Engineering, China Agricultural University,Beijing 100083,China; 4.Japan International Research Center for Agricultural Sciences,Tsukuba 305-8686,Japan; 5.College of Food Science and Technology,Hunan Agricultural University,Changsha 410128,China)

Polymannuronates and polyguluronates were prepared from alginate,and subsequently treated with hydochloric acid for 1 h,2 h and 6 h to obtain mannuronic acid oligomers(M1、M2and M3)and guluronic acid oligomers(G1、G2and G3). Besides,carnosine and mannose were used as control to evaluate the scavenging effect of oligosaccharide on the DPPH,superoxident radical and hydroxyl radical. The results showed that Polymannuronates and Polyguluronates had strong scavenging effects on DPPH and superoxident radical,and the scavenging effect became more efficient with the increasing concentration of oligosaccharide. M3had stronger effects than carnosine on scavenging DPPH. G3was similar with carnosine referring to scavenging effect. M3had a greater effect than M2and M1on scavenging superoxident radical,while G3was slightly lower than carnosine. Polymannuronates and Polygluronates showed less effect on scavenging hydroxyl radical than carnosine and mannite. According to the data,the average degree of polymerization of alginate oligosaccharides had a greater effect on antioxidant ability.

antioxidation;acidic hydrolysis;alginate;alginate oligosaccharides

2015-10-19

胡博旸(1994-),男,本科,研究方向:生物工程,E-mail:1320316538@qq.com。

程永强(1972-),男,教授,研究方向:食品生物技术与功能食品,E-mail:chengyq@cau.edu.cn。

国家“十二五”科技支撑计划项目(2014BAD04B06);国家自然科学基金项目(31171738)。

TS201.1

A

1002-0306(2016)10-0136-05

10.13386/j.issn1002-0306.2016.10.018

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