减肥类保健食品中蒽醌类成分及非法添加化学药物的测定

鲁　辉,钱叶飞,张　斌,郝　刚,陈丽波

(苏州市食品药品检验所,江苏苏州 215104)



减肥类保健食品中蒽醌类成分及非法添加化学药物的测定

鲁辉,钱叶飞,张斌,郝刚,陈丽波*

(苏州市食品药品检验所,江苏苏州 215104)

建立同时测定减肥类保健食品中非法添加化学药物氟西汀、比沙可啶以及蒽醌类成分番泻苷A、番泻苷B、大黄素、大黄素甲醚、大黄酸、大黄酚、芦荟苷和芦荟大黄素的高效液相色谱-二极管阵列检测器(HPLC-DAD)方法。采用Diamonsil C18色谱柱(250 mm×4.6 mm,5 μm),以乙腈(A)-0.02 mol/L乙酸铵溶液(含0.4%乙酸)(B)为流动相,梯度洗脱(0～5 min,85% B;5～25 min,85 %B～35% B;25～50 min,35% B;50～55 min,35% B～85% B),测定波长为268 nm,流速1.0 mL/min,柱温25 ℃。对HPLC-DAD检出氟西汀和比沙可啶的样品进行电喷雾飞行时间质谱(ESI-Q-TOF/MS)一级扫描及二级碎片离子比对进行阳性确证。结果表明:10种待测物线性关系良好(r≥0.995),平均回收率位于90.3%～104.7%之间,RSD均小于5.0%。实际样品测定发现25种减肥类保健食品中有2种检出氟西汀,1种检出比沙可啶,另有1种样品同时检出芦荟苷和芦荟大黄素。本文建立的方法具有较高的选择性和灵敏度,方法分离效果好,耐用性较强,能够用于减肥类保健食品中这10种成分的定性、定量测定。

HPLC-DAD,减肥类保健食品,非法添加,氟西汀,比沙可啶,蒽醌

近年来,肥胖问题日益突出,人们对减肥类保健食品的需求也越来越大。然而,一些不法厂商为了增强功效,竟非法向减肥类保健食品中添加化学药物。由于添加的药物种类和数量往往很随意,某种程度上将严重危害消费者的身体健康[1-2]。为此,国家制定了减肥类保健食品中非法添加酚酞、芬氟拉明、麻黄碱、咖啡因、呋塞米、西布曲明、N-单去甲基西布曲明及N,N-双去甲基西布曲明等8个化学药物的检测标准[3-5]。然而在实际监督检验时常发现某些减肥类保健食品中存在含量较高的标准外成分。此类成分一方面可能是商家非法添加的国家标准外的化学药物;另一方面也可能是减肥类保健品中经常使用的番泻叶、芦荟、大黄、何首乌等原料中的蒽醌类天然成分[6-8]。虽然国家规定上述含蒽醌类成分的中药材可以作为保健食品的原料,然而其过量食用也可能对人体产生严重的危害[9-11],因此这些原料中的蒽醌类成分的含量亦需得到关注。此外,上述原料中的蒽醌类成分较为复杂,在实际的液相分析中时常出现蒽醌类成分与待测定的非添药物色谱峰相重合的情况,而这很可能对疑似阳性结果的紫外光谱判断产生一定的干扰,容易产生假阴性结果。

针对以上问题,本文拟选择添加可能性较大的化学药物氟西汀、比沙可啶以及番泻叶、芦荟、大黄、何首乌等原料的指标性成分番泻苷A、番泻苷B、芦荟苷、大黄素、大黄素甲醚、大黄酸、大黄酚、芦荟大黄素减肥类保健食品作为研究对象;利用高效液相色谱-二极管阵列检测器(HPLC-DAD),建立一个可以同时测定上述10种化合物的定性、定量检测方法。采用该方法对日常抽样的减肥类保健食品进行测定,同时对疑似检出的氟西汀和比沙可啶进行质谱确认,以验证方法的适用性,从而为更加快捷、准确、有效的监督检验及更为有效的评价保健食品的质量提供技术保障。

1　材料与方法

1.1材料与仪器

日常抽样的25种减肥类保健食品包括片剂、胶囊、减肥咖啡、袋泡茶等;番泻苷A(94.7%)、番泻苷B(94.9%)、芦荟苷(95.0%)、大黄酸(100%)、氟西汀(100%)、芦荟大黄素(97.8%)、比沙可啶(100%)、大黄素(100%)、大黄酚(99.6%)、大黄素甲醚(99.1%)标准品购自中国食品药品检定研究院;甲醇、乙腈均为色谱纯,赛默飞世尔科技(中国)有限公司;水为超纯水;其他试剂均为分析纯。

Agilent1260型高效液相色谱仪配1260型分离系统、1260型二极管阵列检测器、EZchrom软件系统,美国安捷伦公司;Agilent6538型UPLC-DAD-ESI-Q-TOF/MS液质联用仪美国安捷伦公司;Thermo Scientific heraeus biofuge primor离心机赛默飞世尔科技有限公司;KQ-300DA数控超声波清洗器昆山市超声仪器有限公司。

1.2溶液的制备

混合对照品贮备液的制备:精密称取减压干燥至恒重的上述标准品适量,加甲醇溶解并稀释至刻度,摇匀,分别制得含番泻苷A 0.288 mg/mL、番泻苷B 0.660 mg/mL、芦荟苷0.296 mg/mL、大黄酸0.172 mg/mL、氟西汀1.336 mg/mL、芦荟大黄素0.246 mg/mL、比沙可啶0.572 mg/mL、大黄素0.244 mg/mL、大黄酚0.244 mg/mL、大黄素甲醚0.800 mg/mL的单标准贮备液,分别精密量取上述单标准贮备液5.0 mL混匀,即得。

供试品溶液的制备:取10倍单次用量的供试品,研细,精密称取适量(约相当于1次用量),置于具塞三角瓶中,精密加入甲醇20 mL,称定重量,超声提取30 min,放冷,称重,用甲醇补足损失的重量,摇匀,过0.45 μm滤膜,取续滤液作为供试品溶液。

阴性空白溶液的制备:称取经测定不含有10种待测成分的供试品(秀中秀牌减肥胶囊),按照上述“供试品溶液的制备”处理,即得。

加标溶液的制备:精密称取阴性空白样品(秀中秀牌减肥胶囊)内容物0.5 g,置20 mL容量瓶中,分别精密加入混合对照品贮备液2.0 mL,再加入甲醇15 mL,超声提取30 min,放冷至室温,用甲醇定容至刻度,摇匀,静置后取上清液过0.45 μm滤膜,平行制备6份。

1.3色谱条件

色谱柱为Diamonsil C18柱(250 mm×4.6 mm,5 μm);流动相为乙腈(A)-0.02 mol/L乙酸铵溶液(含0.4%乙酸)(B)。梯度洗脱:0～5 min,85% B;5～25 min,85% B～35% B;25～50 min,35% B;50～55 min,35% B～85% B;测定波长为268 nm;流速1.0 mL/min;柱温25 ℃;进样体积为10 μL。

1.4质谱条件

采用ESI源;正离子模式;雾化气为氮气;毛细管电压3500 V(+);干燥气温度350 ℃,流速10 L/min;雾化气压力40 psi;碎片电压100 eV;碰撞能量20 eV;扫描范围m/z 100～1000。

1.5数据处理

采用液相色谱仪自带的EZchrom软件对实验所得图谱数据进行积分、命名等处理,使用Excel数据处理软件进行统计分析。

2　结果与讨论

2.1测定波长的选择

将各对照品单标准溶液进行紫外全波长(200～400 nm)扫描,获得了各个成分的紫外光谱图(图1),并将其用于样品中疑似峰的定性判别。通过对比各成分的紫外光谱图,最终综合选择紫外吸收均较强的268 nm作为定量测定波长。

图1　各成分紫外光谱图Fig.1　The UV spectra of the 10 components注:1:番泻苷B,2:番泻苷A,3:芦荟苷,4:大黄酸,5:氟西汀；6:芦荟大黄素,7:比沙可啶,8:大黄素,9:大黄酚,10:大黄素甲醚。

2.2流动相的选择

由于待分析的化合物极性相差较大,采用梯度洗脱更有利于分离。基于价格以及毒性考虑,首先采用甲醇作为有机相,然而经实验摸索发现采用甲醇作为有机相各成分分离情况不佳,且分析时间较乙腈明显延长,整个梯度约需80 min(见图2)。而采用乙腈后发现各成分无论是分离效果还是峰形均较好,且分析时间明显缩短,整个梯度约需50 min(见图4)。因此本文采用乙腈作为有机相。

图2　流动相为甲醇-0.02 mol/L乙酸铵溶液(含0.4%乙酸)时混标色谱图Fig.2　The chromatogram of mixed standards for mobile phase of methanol and 0.02 mol/L ammonium acetate solution(containing 0.4% acetic acid)

为了维持各成分在色谱柱中保留的稳定性,得到较好的重现性,并提高分离选择性及改善峰型,可以选择向流动相中加入缓冲盐溶液以保持体系的酸碱度。本文首先向水相中加入一定量的乙酸,结果发现峰形虽然较好,然而分离效果不佳(见图3)。通过参考其他方法[5]并为后期质谱确认提供便捷,在上述基础上加入了0.02 mol/L的乙酸铵,结果发现各成分得到很好地分离(见图4)。

图3　流动相为乙腈-0.4%乙酸时混标色谱图Fig.3　The chromatogram of mixed standards for mobile phase of acetonitrile and 0.4% acetic acid solution

表1　10种成分的线性回归方程

2.3方法学考察

2.3.1专属性分别取空白提取溶剂(甲醇)、混合对照品溶液、阴性空白溶液和加标溶液进样测定,可看出空白溶剂及阴性空白溶液对各成分的测定不产生干扰;混合对照品溶液和加标溶液在该色谱条件下10种成分均分离良好(图4A～D)。

图4　空白溶剂(A)、混合标准溶液(B)、空白供试品溶液(C)及加标溶液(D)色谱图Fig.4　Typical chromatograms of blank(A), mixed standards solution(B),negative sample solution(C) and recovery test solution(D)注:1:番泻苷B,2:番泻苷A,3:芦荟苷,4:大黄酸,5:氟西汀；6:芦荟大黄素,7:比沙可啶,8:大黄素,9:大黄酚,10:大黄素甲醚。

2.3.2线性关系考察精密量取1.2项“混合对照品贮备液”0.5、1.0、2.0、5.0和10 mL,分别置于20 mL容量瓶中,加甲醇稀释至刻度,摇匀,作为标准曲线溶液。分别吸取10 μL进样测定,记录色谱图,以各成分峰面积(Y)对浓度(X,μg/mL)进行线性回归,回归方程、相关系数见表1。结果发现相关系数均大于0.995,表明各成分的线性关系较好。

2.3.3检测限、定量限将混合对照品贮备液进行一系列的稀释后测定,在信噪比S/N约为3时测得检测限,在信噪比S/N约为10时测得定量限,各成分的检出限、定量限结果见表2。结果表明,各成分检出限均低于1 μg/mL,定量限均低于2 μg/mL,方法的灵敏度可以达到含量测定的要求。

表2　10种成分的检出限、定量限结果

2.3.4精密度精密量取混合对照品贮备液1.0 mL置20 mL容量瓶中,加甲醇稀释至刻度,摇匀,重复进样6次,记录色谱图,计算各个成分峰面积的相对标准偏差,结果发现各个成分的RSD均小于2%,方法精密度较好。

2.3.5对照品溶液稳定性取2.3.4项精密度实验溶液,分别于配制后的第0、1、2、4、12、24 h进样测定,记录色谱图并计算各个成分峰面积的RSD。结果表明10种成分24 h内峰面积的RSD均不大于3%,表明对照品溶液稳定性良好。

2.3.6准确度采用加标回收实验考察方法的准确度。取“1.2项”制备的加标溶液进样测定,计算各个成分的回收率(见表3)。结果发现10个成分回收率均位于90.3%～104.7%之间,RSD均小于5.0%,表明方法能准确的对各成分进行定量测定。

2.3.7供试品溶液稳定性取加标回收溶液,分别于配制后的第0、1、2、4、12、24 h进样测定,记录色谱图并计算各成分峰面积的RSD。结果发现10种成分峰面积的RSD均小于3%,表明供试品溶液中各成分稳定性良好。

表3　加标回收率实验结果(n=6)

2.3.8耐用性本文考察了不同柱温、不同流速及不同厂家色谱柱对分离的影响程度。将原色谱条件中的柱温由25 ℃分别调整为20 ℃和30 ℃,流速由1.0 mL/min调整为1.1 mL/min和0.9 mL/min,分别取混合对照品溶液进样,结果发现10种成分在相应条件下均能得到很好地分离(见图5A～D)。

图5　耐用性实验下混标溶液色谱图Fig.5　The chromatograms of mixed standards for durability tests注:A柱温20 ℃,B柱温30 ℃;C流速1.1 mL/min,D流速0.9 mL/min。

分别取混和对照品溶液,按“1.3项”色谱条件使用Inertsil ODS-3型C18柱(4.6 mm×250 mm,5 μm)进行测定,结果发现对照品溶液各成分在该色谱柱也可以达到基线分离(见图6)。结果表明本方法在不同柱温、流速及不同厂家色谱柱上10种成分均能够得到良好地分离,表明方法的耐用性较好。

图6　Inertsil ODS-3型色谱柱上混标溶液色谱图Fig.6　The chromatogram of mixed standards using Inertsil ODS-3 column

2.4样品测定

取25种日常抽检的减肥类保健食品,按1.2项“供试品溶液的制备”方法进行处理并测定(若测得成分浓度不在线性范围内则将供试品溶液进行稀释),以保留时间和紫外光谱图对检出峰进行初筛,并对疑似检出的非添成分(比沙可啶、氟西汀)进行一级扫描及二级碎片离子(质谱图见图7、图8)比对确认。

图7　比沙可啶对照品准分子离子的二级质谱图Fig.7　ESI-MS2 product ion spectra of bisacodyl

图8　氟西汀对照品准分子离子的二级质谱图Fig.8　ESI-MS2 product ion spectra of fluoxetine

从表4发现2种样品中检出氟西汀,1种样品中检出比沙可啶。氟西汀和比沙可啶并不在当前国标检测的范围内,由此提示对国家标准进行修订的必要性。1种样品中同时检出芦荟苷和芦荟大黄素(该样品标签中标示含有芦荟),二者含量分别为16120 mg/kg和120 mg/kg。

表4　样品中非法添加药物及部分蒽醌类成分含量测定结果(n=3)

3　结论

本文建立了一种可以同时测定减肥类保健食品中可能添加的化学药物氟西汀、比沙可啶以及8种蒽醌类中药成分的分析方法。方法学考察发现10种待测物检出限均低于1 μg/mL;线性关系良好(r≥0.995);平均回收率位于90.3%～104.7%之间,RSD(n=6)均小于5.0%;各成分在不同柱温、不同流速及不同厂家色谱柱上均达到了基线分离。上述方法学验证结果表明方法分离效果好,具有较高的选择性和灵敏度,耐用性较强。在对日常抽样的25种减肥类保健食品检测发现,有2种样品检出氟西汀,1种样品检出比沙可啶,另有1种样品中同时检出中药成分芦荟苷和芦荟大黄素,由此表明方法的针对性较强,适用性良好,可以用于减肥类保健食品中非添药物的测定及蒽醌类中药成分的定性、定量分析。

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[3]国家食品药品监督管理局.药品检验补充检验方法和检验项目批准件2006004[S].2006.

[4]国家食品药品监督管理局.食药监办许[2010]114号文件附件2:减肥类保健食品违法添加药物的检测方法[S].2010.

[5]国家食品药品监督管理局.药品检验补充检验方法和检验项目批准件2012005[S].2012.

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Determination of rhubarb anthraquinones and illegally added chemical drugs in weight-loss functional foods

LU Hui,QIAN Ye-fei,ZHANG Bin,HAO Gang,CHEN Li-bo*

(Suzhou Institute for Food and Drug Control,Suzhou 215104,China)

An analytical method using high performance liquid chromatography coupled with diode array detector(HPLC-DAD)was developed for determination of illegally added chemical drugs fluoxetine and bisacodyl,and rhubarb anthraquinones such as sennoside A,sennoside B,emodin,emodin monomethyl ether,rheinic acid,chrysophanol,barbaloin and aloe-emodin in weight-loss functional foods. The separation was performed on a Diamonsil C18column(250 mm×4.6 mm,5 μm)by gradient elution of acetonitril and 0.02 mol/L ammonium acetate solution(containing 0.4% acetic acid)at a flow rate of 1.0 mL/min:0～5 min,85% B,5～25 min,85% B～35% B,25～50 min,35% B,50～55 min,35% B～85% B. The detection wavelength was 268 nm and the column temperature was 25 ℃. The samples containing fluoxetine or bisacodyl were confirmed by two grade of fragmention comparison using electrospray ionization-quadrupole-time of flight mass spectrometer(ESI-Q-TOF/MS). The correlation coefficient of standard curve for each component in linearity range was not less than 0.995,as well as the average recoveries were 90.3%～104.7% with the relative standard deviations(RSDs)were not more than 5.0%. After determination of 25 weight-loss functional foods,the fluoxetine and bisacodyl were detected in 2 and 1 samples,respectively. The barbaloin and aloe-emodin were both detected in one of the 25 samples. The method is reliable,sensitive,accurate and reproducible. It can be used for the qualitative and quantitative determination of above 10 components in weight-loss functional foods.

HPLC-DAD;weight-loss functional foods;illegally added;fluoxetine;bisacodyl;anthraquinones

2015-10-26

鲁辉(1982-)，男，硕士，主管药师，研究方向：保健食品、化妆品检测与质量控制，E-mail：15862509876@163.com。

陈丽波(1969-)，女，主任药师，主要从事保健食品、化妆品质量控制与评价方面的研究，E-mail：chenlb@szifdc.org.cn。

苏州市科技计划项目-应用基础研究(SYS201583)。

TS207.3

A

1002-0306(2016)10-0088-06

10.13386/j.issn1002-0306.2016.10.008