库欣综合征中FHIT、Ki-67、PCNA的表达及相关因素的研究*

冼晶，黄高明，梁秀就，黄松，蔡劲薇，李励，卢德成，罗佐杰

（1.广西医科大学第一附属医院 内分泌科，广西 南宁 530021；2.广西医科大学公共卫生学院 流行病学与统计学教研室，广西 南宁 530021；3.广西医科大学第一附属医院 病理科，广西 南宁 530021）

论著

库欣综合征中FHIT、Ki-67、PCNA的表达及相关因素的研究*

冼晶1，黄高明2，梁秀就3，黄松1，蔡劲薇1，李励1，卢德成1，罗佐杰1

（1.广西医科大学第一附属医院 内分泌科，广西 南宁 530021；2.广西医科大学公共卫生学院 流行病学与统计学教研室，广西 南宁 530021；3.广西医科大学第一附属医院 病理科，广西 南宁 530021）

目的探讨库欣综合征肾上腺皮质病变中肿瘤抑制基因脆性组氨酸三联体（FHIT）、肿瘤增殖抗原Ki-67、增殖细胞核抗原（PCNA）的表达，探索鉴别库欣综合征肾上腺皮质病变的相关因素。方法应用免疫组织化学方法检测49例库欣综合征肾上腺皮质病变（腺癌14例、腺瘤26例、增生9例）中FHIT、Ki-67、PCNA的表达，对临床病理及生化指标采用有序结果的累积比数Logistic回归分析探索鉴别库欣综合征皮质病变的相关因素。结果FHIT在肾上腺皮质增生中表达最高，腺瘤次之，腺癌最低（分别为100%、96.15%和42.96%），Ki-67与PCNA在肾上腺皮质腺癌的表达最高，腺瘤次之，增生最低（分别为85.71%、7.69%、0.00%和100%、96.15%、77.78%）。应用Logistic回归分析发现FHIT、PCNA两个因素与鉴别腺癌、腺瘤、增生的关系更为密切。结论FHIT、Ki-67和PCNA的表达与库欣综合征肾上腺皮质病变密切相关。Logistic回归分析提示FHIT、PCNA与鉴别诊断的关系更为密切。

库欣综合征；FH IT；Ki-67；PCNA；Logistic回归分析

库欣综合征（Hypercortisolism，cushing syndrome）肾上腺皮质病变表现为皮质腺癌、腺瘤及增生。3者在临床上均可表现为库欣综合征，但治疗方法及预后各不相同，而在临床及病理形态学的鉴别诊断上有较大难度[1]。目前尚未见库欣综合征肾上腺皮质腺癌、腺瘤、增生的诊断相关因素的研究报道。本研究应用免疫组织化学方法，检测库欣综合征肾上腺皮质病变（腺癌、腺瘤及皮质增生）中肿瘤抑制基因脆性组氨酸三联体（fragile histindine triad，FHIT）、肿瘤增殖抗原Ki-67（Ki-67 nuclear antigen，Ki-67）、增殖细胞核抗原（proliferation cell nuclear antigen，PCNA）的表达并探讨它们与皮质病变的关系。对库欣综合征的各项临床病理及生化指标进行Logistic回归分析，探讨鉴别库欣综合征肾上腺皮质腺癌、腺瘤、增生的相关因素，旨在寻找在库欣综合征肾上腺皮质病变中有鉴别诊断意义的客观指标。

1　资料与方法

1.1一般资料

组织标本为广西医科大学第一附属医院2005～2012年手术切除、经病理证实的库欣综合征肾上腺皮质病变石蜡包埋标本49例。其中，肾上腺皮质腺癌14例，腺瘤26例，增生9例；男性19例（37.5%），女性30例（62.5%）；年龄5~68岁，平均（35.84±16.18）岁。全部病例都有Cushing综合征典型的临床症状、体征和实验室改变。全部病例行小剂量地塞米松抑制试验均不被抑制。该研究获得本单位伦理委员会的批准及受试者签署的知情同意书。

1.2检测方法

采用EliVision TM super二步法，参照试剂盒说明书进行免疫组织化学染色。主要染色步骤：切片脱蜡和水化后抗原修复，一抗FHIT（工作浓度1∶100）、Ki-67（即用型）、PCNA（即用型）室温下孵育60min，然后滴加放大剂、多聚酶结合物，DAB显色，复染等。兔抗人FHIT浓缩型多克隆抗体购自北京中山生物技术公司，鼠抗人Ki-67、PCNA单克隆抗体和EliVision TM super检测试剂盒为福州迈新生物技术公司产品。

1.3结果判断

根据多数文献的判断方法，综合考虑切片中阳性细胞着色强度、阳性细胞占所观察同类细胞数的百分比两项指标，判断免疫组织化学结果：细胞核或细胞质呈棕褐色或棕黄色颗粒者为阳性细胞。FHIT蛋白定位于细胞质。Ki-67、PCNA阳性定位于细胞核。按染色强度评分：无色0分，浅黄色1分，棕黄色2分，棕褐色3分；再按阳性细胞所占的百分比评分：阳性细胞<5%为0分，6%～25%为1分，26%～50%为2分，51%～75%为3分，>75%为4分。染色强度与阳性细胞百分比的乘积：0分为阴性（-），1～4分为弱阳性（+），5～8分为中等阳性（++），9～12分为强阳性（+++）。Ki-67阳性定位于细胞核，阳性细胞数<10%为阴性（-），阳性细胞数≥10%为阳性：其中10%～25%为弱阳性（+），25%～50%为中等阳性（++），>50%为强阳性（+++）[2-3]。

1.4统计学方法

所有数据均采用SPSS 19.0统计学软件包进行处理。计量指标采用均数±标准差（）表示，组间差异比较用方差分析及其两两检验（q检验）；分类资料用率或构成比（%）表示，组间比较采用χ2检验或Fisher精确概率法，其两两比较采用Bonferroni检验水准调整法；因素筛选采用有序结果的累积比数Logistic回归分析。P<0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1激素及生化指标情况

血皮质醇各时间段3组间差异无统计学意义（P>0.05）。血促肾上腺皮质激素（adreno cortico tropic hormone，ACTH）8AM和0AM 2组间差异有统计学意义（P<0.05），而4PM组间差异无统计学意义（P>0.05）。24 h尿17-OH、24 h尿17-KS以及血钾3组间差异均无统计学意义（P>0.05）。激素及生化指标情况见表1。

2.2库欣综合征肾上腺皮质病变中FHIT、Ki-67、PCNA的表达

库欣综合征肾上腺皮质病变中FHIT的表达，腺癌的总阳性率均较腺瘤（χ2=11.925，P=0.001）及皮质增生低（χ2=5.568，P=0.018）。腺癌总阳性率为42.86%，仅表现为弱阳性，其余全部为阴性。腺瘤与皮质增生在总阳性率的比较中无统计学意义（Fisher精确概率P=1.000）。见表2。

库欣综合征肾上腺皮质病变中Ki-67的表达，总阳性率的表达腺癌较腺瘤（χ2=21.041，P< 0.001）、皮质增生为高（χ2=12.878，P<0.001）。腺瘤与皮质增生在总阳性率的表达比较中无统计学意义（Fisher精确概率P=1.000）。见表3。

表1　激素及生化指标情况 （）

表1　激素及生化指标情况 （）

组别腺癌腺瘤皮质增生F值P值血皮质醇/（nmol/L）8AM　897.09±231.87　821.83±247.53　920.26±192.22　0.781　0.464 4PM　519.93±239.34　666.41±226.16　798.49±306.61　3.272　0.047 0AM　523.54±128.64　531.65±269.70　771.38±337.63　2.996　0.060血ACTH/（pmol/L）8AM　3.55±1.56　3.78±1.63　5.85±1.53　6.055　0.005 4PM　3.27±1.89　2.49±0.92　3.56±0.81　3.363　0.043 0AM　3.99±1.78　2.73±1.30　3.36±1.27　3.414　0.041 24 h尿17-OH/（μmol/L）21.20±10.08 16.29±8.96 15.71±5.58 1.487 0.237 24 h尿17-KS/（μmol/L）25.43±11.88 17.65±8.57 18.79±5.42 3.152 0.052血钾/（mmol/L）3.69±0.59 3.32±0.65 3.30±0.79 1.489 0.236

表2　FHIT在皮质醇增多症肾上腺病变中的表达　例（%）

库欣综合征肾上腺皮质病变中PCNA的表达，虽然腺瘤、腺癌、皮质增生3者的总阳性率总的差异无统计学意义（χ2=4.560，P=0.102），但是在分级比较中，腺癌在较高阳性（++/+++）的表达比腺瘤（χ2=4.660，P=0.031）及增生高（χ2=9.136，P=0.003）；腺瘤与增生差异无统计学意义（χ2=1.571，P=0.210）。见表4。

2.3库欣综合征肾上腺皮质病变中FHIT、Ki-67、PCNA表达与临床指标的关系

49例组织标本中FHIT、Ki-67、PCNA表达与患者的年龄、性别、发病部位（左侧或右侧）无关（P> 0.05）。见表5。

2.4库欣综合征肾上腺皮质病变影响因素分析

分析库欣综合征与各项临床及生化指标的关系，用logistic回归作因素筛选。由于库欣综合征的组织学类型分为皮质增生、腺瘤、腺癌3类，属有序多分类的资料，故采用有序结果的Logistic回归分析。因素筛选采用逐步法，入选α水平为0.05，剔除α水平为0.10。方程的拟合优度检验：χ2=9.422，P=0.991>0.05，说明方程拟合效果好。分析结果表明：只有FHIT和PCNA 2个因素与库欣综合征肾上腺皮质病变有关，FHIT呈负相关，PCNA呈正相关。见表6。

表5　库欣综合征肾上腺皮质病变中FHIT、Ki-67、PCNA表达与临床指标的关系　例（%）

表6　多因素有序Logistic回归分析结果

3　讨论

FHIT是1996年OHTA等[4]发现的拟定的抑癌基因，其基因结构和功能改变与人类多种恶性肿瘤的发生、发展有关[5]。在人类多种恶性肿瘤及多种恶性肿瘤细胞系中FHIT基因呈现高频率的纯合缺失、杂合缺失或异常转录。大约70%的人类上皮肿瘤和某些癌出现FHIT基因缺失、甲基化或蛋白质表达减少[6]。各种致癌因素影响亦可使FHIT蛋白表达受阻，从而使FHIT蛋白表达降低。病变组织中检测到FHIT蛋白表达的缺失以及缺失的程度与其良恶性及预后有关，相反FHIT蛋白的高表达提示为良性[7]。本研究发现，在库欣综合征肾上腺皮质病变中，FHIT在腺癌的表达率最低（P<0.05），且全部为阴性或弱阳性，皮质增生的表达率最高（P<0.05），且全部为强阳性表达，腺瘤的表达介于两者之间，提示在库欣综合征肾上腺皮质病变中，肾上腺皮质腺癌的FHIT基因转录产物异常及其蛋白缺失或减少较腺瘤和增生更为明显，FHIT基因转录产物异常及其蛋白表达的改变与肾上腺皮质病变的良恶性有密切关系，其表达下调与肾上腺皮质腺癌发生、发展有密切关系。本研究同时发现FHIT在肾上腺皮质腺癌中除有阴性表达外，另有6/14例为弱阳性表达，提示FHIT基因转录产物异常及其蛋白缺失或减少在恶性肿瘤中亦非全部缺失，部分特别是恶性程度较低腺癌仅为蛋白表达的减少而非完全缺失。

Ki-67是目前已知的增殖抗原中最具增殖能力及应用最广泛的增殖细胞标记之一，与肿瘤恶性程度、浸润、转移、复发密切相关[8-9]。本研究发现库欣综合征肾上腺皮质病变中，Ki-67在腺癌的表达率最高（P<0.05），较腺瘤和增生更为明显（P<0.05），提示皮质腺癌的细胞增殖较腺瘤和皮质增生更为活跃。另外发现Ki-67的表达随增生、腺瘤、腺癌的细胞增殖程度的提高，表达的阳性强度增加，阳性率亦有增加。提示Ki-67表达的高低可反映肿瘤的良恶性。

PCNA在肿瘤细胞中的表达情况可以敏感地反映肿瘤细胞的增殖活性，与肿瘤的生物学行为及恶性程度密切相关。较高的PCNA表达率反映了高水平的细胞增殖状态[10]。本研究发现，在库欣综合征肾上腺皮质病变中，PCNA的表达在腺癌最高，腺瘤次之，增生最低（P<0.05）。从增生、腺瘤到腺癌，随着细胞增殖水平的提高，PCNA表达的阳性强度亦随之增加。且由于增生和腺瘤的细胞增殖水平不同，PCNA表达高低也可以作为两者的判断指标。

在临床上，肿瘤大小常作为区别肿瘤良恶性的指标。肾上腺皮质肿瘤直径超过5 cm应考虑有恶变的可能。而肾上腺位于腹后腔，肿瘤太小时不易触到，体格检查时发现有腹部包块提示肿瘤直径较大。能否触及腹部包块及肿瘤大小对鉴别库欣综合征肾上腺皮质病变的类型有价值。库欣综合征超过半数患者出现骨量减少或病理性骨折。皮质腺癌的骨量减少甚至病理性骨折更明显。其原因可能与皮质醇增多引起的骨量丢失过多、破骨增加等因素有关。但骨量减少或骨折是否与肿瘤的良恶性有关尚未见相关报道。临床上库欣综合征患者血皮质醇8AM、4PM和0AM均可出现升高并伴有节律紊乱。4PM血皮质醇可能因受影响因素较多而未见有相关统计的报道。库欣综合征患者由于肾上腺皮质腺癌、腺瘤或增生自主分泌皮质醇增多，抑制垂体ACTH的分泌，使血ACTH水平降低。8AM血ACTH水平可能是鉴别肾上腺皮质腺癌、腺瘤及增生的指标之一。

多因素Logistic回归分析模型结果只有FHIT、PCNA两个因素进入模型。提示FHIT和PCNA这两个因素与鉴别诊断的关系更为密切。主要原因是其他因素与这两个因素具有较高的相关性，因此，在多因素分析时被排除在方程之外。另外研究的病例数相对较少也是影响多因素分析结果的可能原因。

[1]ISIDORIA M,KALTSAS G A,MOHAMMED S,et al.Discriminatory value of the low-dose dexamethasone suppression test in establishing the diagnosis and differential diagnosis of cushing's syndrome[J].J.Clin Endocrinol Metab,Nov 2003,88(11): 5299-5306.

[2]KHALIFEH I,MUNKARAH A R,SCHIMP V,et al.The impact of c-kit and Ki-67 expression on patients prognosis in advanced ovarian serous carcinoma[J].Int J Gynecol Pathol,2005,24(3): 228-234.

[3]KISIELEWSKA J,LU P,WHITAKER M.GFP-PCNA as an S-phase marker in embryos during the first and subsequent cell cycles[J].Bio of the Cell,2005,97(3):221-229.

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[7]SYED V,MUKHERJEEK,LYOUS-WEILER J,et al.Identification of ATF-3,caveolin-1,DLC-1,and NM23-H2 as putative antitumorigenic,progesterone-tegulated genes for ovarian cancer cells by gene profiling[J].Oncogene,2005,24:1774-1787.

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[9]VERNILLO R,LORENZI B,BANDUCCI T,et al.Immunohistochemical expression of p53 and Ki67 in colorectal adenomas and prediction of malignancy and development of new polyps[J].Int J Biol Markers,2008,23(2):89-95.

[10]赵阳,李晓军,隋昕,等.PCNA和Caspase-3在肺癌组织中的表达及意义[J].细胞与分子免疫学杂志,2010,26(2):154-156.

（张蕾编辑）

Expression of FHIT，K i-67 and PCNA in Cushing syndrome and related factors*

Jing Xian1,Gao-ming Huang2,Xiu-jiu Liang3,Song Huang1, Jing-wei Cai1,Li Li1,De-cheng Lu1,Zuo-jie Luo1
（1.Department of Endocrinology，the First Affiliated Hospital of Guangxi Medical University，Nanning，Guangxi530021，China；2.Department of Epidmiology and Statistics，Public Health College of Guangxi Medical University，Nanning，Guangxi530021，China；3.Department of Pathology，the First Affiliated Hospital of Guangxi Medical University，Nanning，Guangxi 530021，China）

Objective To study the expression of FHIT，Ki-67 and PCNA in hypercortisolism of various adrenocortical diseases and explore the correlative factors of the differential diagnosis of hypercortisolism of adrenocortical adenocarcinoma，adenoma and hyperplasia.Methods The expressions of FHIT，Ki-67 and PCNA were detected by immunohistochemical staining in 49 cases of adrenocortical diseases，which included 14 cases of adrenocortical carcinoma，26 cases of adrenocortical adenoma and 9 cases of adrenocortical hyperplasia.The factors correlated to differential diagnosis of hypercortisolism of various adrenocortical diseases were analyzed statistically by ordinal logistic regression.Results The expression rate of FHIT in adrenocortical hyperplasia，adrenocortical adenoma and adrenocortical adenocarcinoma was 100.00%，96.15%and 42.96%，respectively.The expression rate of Ki-67 in adreno－cortical adenocarcinoma and adrenocortical adenoma was 85.71%and 7.96%，respectively，while there was no expression atall in adrenocortical hyperplasia（0.00%）.The expression rate of PCNA in adrenocortical adenocarcinoma，adrenocortical adenoma and adrenocortical hyperplasia was 100.00%，96.15%and 77.78%，respectively.Logistic regression single-factor analysis revealed that 8 factors including FHIT，Ki-67，PCNA，abdominal mass，tumor size，osteopenia or fracture，serum cortisol level（4 pm）and blood ACTH level（8 am）were possibly linked to the differential diagnosis of hypercortisolism of the adrenocortical diseases，and multiple-factor analysis showed that FHIT and PCNA were the factors closely correlated to differential diagnosis of adrenocortical carcinoma，adenoma and hyperplasia. Conclusions The expressions of FHIT，Ki-67 and PCNA are strongly related with hypercortisolism of various adrenocortical diseases.They might be applied as the markers for distinguishing adrenocortical carcinoma，adrenocortical adenoma and adrenocortical hyperp lasia.The results of logistic regression analysis suggest that FHIT，Ki-67，PCNA，abdominal mass，tumor size，osteopenia or fracture，serum cortisol（4 pm）and blood ACTH level（8 am）may be the correlated factors of differential diagnosis of adrenocortical carcinoma，adenoma and hyperplasia；moreover，FHIT and PCNA are the factors closely correlated to differential diagnosis of hypercortisolism of adrenocortical diseases.

hypercortisolism；FHIT；Ki-67；PCNA；logistic regression

R 586.2

A

10.3969/j.issn.1005-8982.2016.14.008

1005-8982（2016）14-0037-05

2015-11-30

国家自然科学基金项目（No：81060220）；广西自然科学基金项目（No：2011GXNSFA018172）；广西留学回国人员科学基金（No：桂科回0731019）；广西青年科学基金（No：桂科青0728073）；广西卫生厅自筹经费科研课题项目（No：Z20133027）

罗佐杰，E-mail：zluo888@163.com