Follistatin、Activin A与BMP-4在大鼠脑发育过程中的表达及意义

卢彦春，张 蕾，穆长征，李伟伟，金 辉

(1辽宁医学院生物化学教研室，辽宁锦州 121000;2辽宁医学院附属第三医院)

研究表明，多种细胞因子及信号通路共同参与神经分化的调控机制，其中卵泡抑素(FS)能够诱导神经分化，并拮抗激活素(Activin)的生物活性进一步抑制胞内的Smad3的信号激活［1］。有学者认为，FS作为Activin特异结合蛋白，还可与TGF-β家族的其他成员结合，如骨形态发生蛋白(BMPs)、myostatin等，并抑制BMP信号而达到神经诱导作用的。而最新研究表明，FS没有阻止BMP信号，其功能主要是作为 Activin抑制剂，而不是 BMP配体［2］。2010年4月～2012年3月，我们通过观察鼠神经发育不同阶段和部位FS、Activin A与BMP-4基因的表达变化及定位情况，以探讨神经细胞诱导和分化的可能机制。

1 材料与方法

1.1 动物及分组 取同期受孕SD大鼠30只，由辽宁医学院科学实验动物中心提供。将30只大鼠按照胎鼠发育时间分为胚胎8.5 d(E8.5组)、13 d(E13组)、18 d(E18组)及出生后3 d(P3组)、7 d(P7组)、30 d(P30组)各5只。

1.2 FS、Activin A、BMP-4 表达检测 E8.5 组、E13组、E18组中每只孕鼠取5只胎鼠，断头取脑，经40 g/L(4%)多聚甲醛固定;P3组、P7组、P30组各取5只幼鼠经腹腔麻醉，打开胸腔，用300 mL(0.1 mol/L)PBS(pH7.4)经左心室灌注冲洗，再用40 g/L(4%)多聚甲醛磷酸盐缓冲液300 mL缓慢灌注固定。应用脑立体定位仪分别切取包含皮质、纹状体、海马、嗅球组织的脑片，石蜡包埋，连续进行冠状切片(厚度为5 μm)，每4张取1张，行免疫组化染色。观察 FS、Activin A、BMP-4 在皮质、纹状体、海马、嗅球处表达。免疫组化染色操作步骤按SABC免疫组化染色试剂盒操作说明进行。

1.3 统计学方法 所得数据输入计算机，用SPSS for Windows 10.0版本软件进行t检验和方差分析，结果以±s表示。检验水准α=0.05。

2 结果

2.1 皮质 各组皮质阳性细胞分布均匀，FS与Activin A在E8.5组阳性细胞数最多，在E13组皮质的锥体细胞层，细胞着色较深，提示此层细胞FS(图1)与Activin A(图2)含量较多，P7组与P30组阳性细胞较少且着色最弱。BMP-4在E8.5～P7组阳性细胞较少，在P30组阳性细胞显著增多，可见胞质染色较强的细胞，主要分布于颗粒层和锥体细胞层(图3)。

2.2 纹状体 FS与Activin A在E8.5组阳性细胞数最多，E13组与E18组阳性细胞数减少且着色较强，可见胞质染色较强的细胞，主要分布于颗粒层(FS见图4、Activin A见图5)，P3组阳性细胞数低于E18组，P7组和P30组阳性细胞较少且着色最弱。BMP-4在E8.5组到P7组阳性细胞较少，着色相对较弱，在P30组阳性细胞显著增高，细胞着色深，主要分布于颗粒层(图6)。

2.3 海马 FS与Activin A在E8.5组阳性细胞数最多，E13组明显少于E18组，齿状回阳性细胞体积较小，数目较多，E8.5组到P7组各亚区阳性细胞数都较多，细胞着色深，主要分布在锥体细胞层、颗粒层(FS见图7、Activin A见图8)，P30组阳性细胞数进一步减少。BMP-4在E8.5组到P7组阳性细胞数极少且着色极弱，P30组阳性细胞着色较强，细胞着色深，集中在锥体细胞层、颗粒层(图9)。

2.4 嗅球 FS和Activin A在E8.5组阳性细胞最多。E13组阳性细胞数略减少，E18组与P3组阳性细胞数略少于E13组，分布于各层，胞质呈深棕黄色，核空泡状，僧帽细胞可见阳性突起(FS见图10、Activin A见图11)，P7组到 P30组进一步减少。BMP-4在E8.5组到P7组阳性细胞数较少，P30组阳性细胞增多，呈高表达，阳性细胞均在纤维层、僧帽细胞层、颗粒细胞层、髓层较多(图12)。

图1 ～12 大鼠大脑皮质、纹状体、海马、嗅球内FS、Activin A与BMP-4免疫组化染色(×400)

3 讨论

研究表明，多种细胞因子及信号通路共同参与神经分化的调控机制，成体神经发生亦受缺血、运动等众多因素的影响［3，4］。其中，Fs能够诱导神经分化，并拮抗Activin的生物活性进一步抑制胞内的Smad3 的信号激活［1］。Shoji-Kasai等［5］发现，体外培养的海马神经元突触数量和树突长度的增加有赖于Activin A。新近的实验表明，Activin A具有促进原代培养背根神经节神经元神经突起生长、抑制神经损伤分子NO释放作用，与神经生长因子具有协同效应［6，7］。根据配体中的半胱氨酸残基的分布将TGF-β家族成员区别为三个亚群，即标准TGF-βs家族、activin/inhibins家族、BMPs家族。Fs与 Activin和Myostatin以高亲和力结合形成基本不可逆的复合物，阻止了受体配体的相互作用，在脊椎动物中几个作为TGF-β配体亚家族的拮抗剂均与Fs有关。

Bickel等发现，BMP和Activin配体均为FS作用的靶点。而最新研究表明，FS没有阻止BMP信号，其功能主要是作为Activin抑制剂，而不是BMP配体，这与Bickel的研究不同。本实验发现大鼠大脑皮质和纹状体内FS、Activin A在E8.5组阳性细胞数最多，在E13组与E18组阳性细胞数减少，P3组阳性细胞数低于E18组，P7组及P30组细胞着色最弱，而BMP-4基因呈现相反的表达，在E8.5组至P3组着色相对较弱，在P7组开始增强，在P30组阳性细胞显著增高，提示Fs对 ACT的拮抗特点与Bickel研究结果相吻合，而Fs与BMP-4的表达呈相反波动趋势。

众所周知，神经板是最早出现的神经系统发育的结构。参与神经板发生的主要有BMP、Fs、Chorclin和Noggin。Fs是一类分泌性因子，表达于原肠胚期的组织原区及动物极性外植体中。新近研究发现，皮层、纹状体、黑质、杏仁核、海马CAI区、脑干背侧迷走神经复合体、室旁核都有神经发生［8］。本文结果表明，FS、Activin A在大鼠海马E8.5组阳性细胞数最多，E13组明显低于E8.5组，而BMP-4在此时的着色极弱，提示FS与Activin A蛋白能够抑制BMP-4的作用，可能对胚胎期和成年期海马的神经发生调控起重要作用。近来研究也表明，在出生后20 d至成年阶段齿回能产生颗粒细胞，然而和胚胎期及新生期相比，数量明显减少［8］。成年大鼠神经元前体细胞的迁移流主要有两条路径:一条是从SVZ到嗅球的RMS;另一条是位于皮层和胼胝体周围迁移流［3］。研究发现，大鼠嗅球存在两次嗅感觉神经细胞凋亡高峰，分别在胚胎13 d和出生后第5天，随着嗅球的神经发生，嗅感觉神经细胞发育成熟［9，10］。本研究发现，FS 和 Activin A 在 E8.5 组嗅球阳性细胞分布于各层，着色最强。E13组阳性细胞数略减少，而BMP-4在此时阳性细胞数较少。FS和ACT在E18组至生后P3组呈中等强度表达，阳性细胞数略少于E13组，二者在P7组进一步减少，P30组降至最低。而BMP-4在P7组阳性细胞数较少，P30组阳性细胞增多，呈高表达，由此推测FS和Activin A蛋白能够抑制BMP-4的作用从而阻止嗅上皮的嗅感觉神经细胞凋亡的发生。

总之，FS在神经诱导的调控机制的过程中与Activin A和BMP-4密切相关，作为外胚层的内部因素在正常发育中有重要意义。但神经发育调控机制复杂，尚需进一步的探索研究。

［1］李伟伟，张蕾，田力.卵泡抑素诱导骨髓间充质干细胞分化为神经元样细胞［J］.神经解剖学杂志，2009，25(6):616-620.

［2］Pentek J，Parker L，Wu A，et al.Follistatin preferentially antagonizes activin rather than BMP signaling in drosophila［J］.Genesis，2009，47(4):261-273.

［3］张涛，王景周.成体脑内神经发生和脑缺血对其影响［J］.中华神经医学杂志，2009，8(2):207-210.

［4］王红星，徐冬晨，王彤.中枢神经再生策略:增强神经因子介导的再生环境“允许”作用［J］.中国康复医学杂志，2008，23(4):382-384.

［5］Shoji-Kasai Y，Ageta H，Hasegawa Y，et al.Activin increases the number of synaptic contacts and the length of dendritic spine necks by modulating spinal actin dynamics［J］.Cell Sci，2007，120(Pt 21):3830-3837.

［6］方琳，柳忠辉，刘永茂.激活素促进鸡胚神经节神经突起生长作用［J］.动物学杂志，2006，41(6):23-28.

［7］方琳，刘永茂，葛敬岩.激活素结合蛋白阻断激活素诱导鸡胚神经节神经突起生长作用及其机制研究［J］.中风与神经疾病杂志，2007，24(4):395-397.

［8］Raymond AD，Kucherepa NN，Fisher KR，et al.Neurogenesis of oxytocin-containing neurons in the paraventricular nucleus(PVN)of the female pig in 3 reproductive states:puberty gilts and lactating sows［J］.Brain Res，2006，1102(1):44-51.

［9］West MJ，Slomianka L，Gundersen HL.Unbiased stereological estimation of the total number of neurons in the subdivision of the rat hippocampus using the optical fractionator［J］.Anat Rec，1991，231(4):482-497.

［10］Cowan CM，Roskams AJ.Caspase 3 and Caspase 9 mediate developmental apoptosis in the mouse olfactory system［J］.J Comp Neurol，2004，474(1):136-148.