溃疡性结肠炎患者外周血及结肠黏膜TNF-a、IL-6和IL-2变化的临床意义*

黎莉，杨卫文，谭松，刘正勇，何天兰，戴振媛

（贵州省贵阳市第二人民医院 消化内科，贵州 贵阳 550081）

论著

溃疡性结肠炎患者外周血及结肠黏膜TNF-a、IL-6和IL-2变化的临床意义*

黎莉，杨卫文，谭松，刘正勇，何天兰，戴振媛

（贵州省贵阳市第二人民医院 消化内科，贵州 贵阳 550081）

目的考察溃疡性结肠炎（UC）患者外周血及结肠黏膜肿瘤坏死因子α（TNF-α）、白细胞介素6（IL-6）和白细胞介素2（IL-2）变化并探讨其意义。方法收集2008年1月-2013年1月贵阳市第二人民医院门诊及住院的活动期UC患者85例。根据病情严重程度将患者分为3组：轻度31例、中度25例和重度29例，选肠镜检查正常的健康体检者25例为对照组。检测所有受试者，UC患者治疗前后外周血和结肠黏膜TNF-α、IL-6和IL-2水平，并进行比较。结果治疗前，各个UC组外周血和结肠黏膜TNF-α和IL-6水平明显高于对照组（P<0.05），IL-2明显低于对照组（P<0.05），随着严重程度增加，TNF-α和IL-6增高，IL-2降低，治疗后，UC组外周血和结肠黏膜TNF-α、IL-6及IL-2水平和对照组差异无统计学意义（P> 0.05），外周血TNF-α分别与IL-6和IL-2呈正相关（r=0.733，P=0.009）和负相关（r=-0.674，P=0.017），IL-6和IL-2呈负相关（r=-0.615，P=0.032），结肠黏膜的TNF-α分别与IL-6和IL-2呈正相关（r=0.755，P=0.005）和负相关（r=-0.584，P=0.042），IL-6和IL-2呈负相关（r=-0.533，P=0.049），外周血TNF-α和IL-6分别与Geboes呈正相关（r=0.684，P=0.012；r=0.722，P=0.0011），IL-2与Geboes呈负相关（r=-0.631，P=0.021）。所有患者随访3、6、12和24个月，UC复发者分别为1、3、3和4例，合计11例，失访者分别为1、2、1和2例，复发率分别为1.19%（1/84）、3.66%（3/82）、3.70%（3/81）和5.06%（4/79），合计复发率为13.90%。结论UC患者外周血及结肠黏膜TNF-a、IL-6和IL-2与UC严重程度相关，评估TNF-α、IL-6和IL-2有助于判断UC治疗的“黏膜愈合”，对预后有较准确的指导价值。

溃疡性结肠炎；TNF-a；IL-6；IL-2

溃疡性结肠炎（ulcerative colitis，UC）是一种病因不明的慢性、非特异性肠道炎症反应，病变多累及直肠和乙状结肠的黏膜和黏膜下层，并可向全结肠蔓延。临床以腹痛、腹泻、黏液脓血便和里急后重等症状多见，病情多延绵，发作和缓解交替发生。临床对UC没有特效的药物，因此治疗的目标仅止于“内镜下黏膜愈合”及降低或延迟UC复发。现存的矛盾是，这种“黏膜愈合”后可能仍存在组织学的炎症反应，炎症反应的存在有助于UC复发，是UC反复的病理基础。因此参与炎症反应的炎症因子的研究对于探讨UC病理特点和制定治疗方案具有积极意义[1]。肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor，TNF-α）、白细胞介素6（Interleukin 6，IL-6）和白细胞介素2（Interleukin-2，IL-2）是研究相对成熟的炎症因子[2-3]，本课题拟考察结肠黏膜与外周血的TNF-α和IL-6、IL-2变化，为临床UC研究提供参考。

1　资料与方法

1.1研究对象

经贵阳市第二人民医院伦理委员会同意，收集2008年1月-2013年1月门诊及住院的活动期UC患者85例。其中，男性53例，女性32例；年龄19～66岁，平均（39.5±3.12）岁；均经电子结肠镜和病理检查确诊，符合2007年5月济南全国炎症性肠病研讨会修订的《对我国炎症性肠病诊断治疗规范的共识意见》中初发型UC诊断标准[4]。根据临床症状和病情严重程度，将患者分为3组：轻度组31例、中度组25例和重度组29例；另选肠镜检查正常的健康体检者25例为对照组。其中，男性17例，女性8例，年龄20～61岁，平均（40.1±8.2）岁。UC组与对照组的年龄及性别构成均具可比性（P>0.05）。

1.2临床排除标准

①细菌性痢疾、阿米巴痢疾、肠结核等感染性结肠炎，以及克罗恩病、放射性肠炎、缺血性肠炎、变态反应性肠炎、结直肠癌患者；②外科手术后UC以及有并发症如中毒性巨结肠、肠穿孔、下消化道大出血、癌变的患者；③其他自身免疫性疾病患者；④妊娠和/或哺乳期妇女。

1.3试剂和仪器

TNF-α、IL-6及IL-2试剂盒均购自基因科技（上海）有限公司，MK3全自动酶标仪，赛默飞世尔公司。

1.4方法

1.4.1治疗所有患者均给予柳氮磺氨吡啶4 g/d，分4次服用，中、重度组加用地塞米松10mg/d或甲基强的松龙80mg/d，3 d后逐渐减量，疗程2个月。

1.4.2外周血TNF-α、IL-6及IL-2测定所有受试者空腹12 h后，收集清晨肘静脉血10ml，分离得外周血，于-20℃冰箱冷冻待测。严格参照ELISA试剂盒说明书，用酶标仪在450 nm波长处依次测定各组吸光度（OD值），通过标准曲线计算外周血TNF-α、IL-6及IL-2水平（单位均为ng/L）。UC患者治疗结束后再次同法测定TNF-α、IL-6及IL-2水平，ELISA法检测由专人盲法操作。

1.4.3结肠黏膜TNF-α、IL-6及IL-2测定所有标本均由10%中性甲醛固定，石蜡包埋后，4μm连续切片，采用链霉素抗生物素蛋白-过氧化物酶连结（SP）法，浓度为TNF-α 1∶180、IL-6 1∶200、IL-2 1∶200，参考试剂说明书进行操作。磷酸盐缓冲液（PBS）代替一抗为阴性对照。结果判定：以细胞膜或细胞质中出现棕黄色物质者定TNF-α、IL-6、IL-2阳性细胞。利用MIAS图像分析系统测定200倍视野下每张切片选择5处阳性细胞测定其平均光密度值，检测由专人盲法操作。

1.5愈合判断

治疗结束后，由同一经验丰富的内镜医生复查肠镜，在原炎症最明显处取组织活检，行Geboes评分，Geboes<3.1分为“组织学愈合”，≥3.1分作为炎症活动指标（慢性炎症细胞明显浸润，上皮内有中性粒细胞增多，伴或不伴隐窝破坏及糜烂）[5]，判断UC患者是否存在黏膜低度炎症反应。

1.6随访

治疗后随访2年，主要记录治疗后UC患者是否出现腹痛、腹泻和黏液便等肠易激综合征样症状；对疑似低度炎症反应患者需进行结肠镜及病理组织学检查，再给予对症治疗。

1.7统计学方法

应用SPSS 17.0统计软件进行数据处理，计量资料用均数±标准差（）表示，多组均数比较采用方差分析，两两比较采用LSD-t检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1UC治疗前后各组外周血 TNF-α、IL-6和IL-2及Geboes指数水平比较

治疗前，UC轻度组 [TNF-α：t=3.584，P=1.183（10-3），IL-6：t=2.617，P=1.375（10-2），Geboes：t=-21.201，P=1.316（10-19）]；UC中度组 [TNF-α：t=10.750，P=1.182（10-10），IL-6：t=10.191，P=3.394（10-10），Geboes：t=23.385，P=5.013（10-18）]；UC重度组 [TNF-α：t=15.342，P=3.712（10-15），IL-6：t=6.941，P=1.529（10-7），Geboes：t=45.454，P=8.783（10-28）]。外周血TNF-α、IL-6和Geboes水平明显高于对照组（P<0.05）；UC轻度组[t=3.832，P=6.051（10-4）、UC中度组t=10.191，P=3.399（10-10）和UC重度组t=16.575，P=5.246（10-16）]外周血的IL-2明显低于对照组（P<0.05），随着严重程度增加，TNF-α [F=134.962，P=1.153（10-26）]和IL-6[F=13.285，P=1.004（10-5）]增高，IL-2[F=104.292，P=2.970（10-23）]降低，治疗后，UC组外周血TNF-α（F=0.262，P=0.852）、IL-6（F=1.813，P=0.149）、IL-2（F=0.626，P=0.600）和Geboes（F=0.008，P=0.999）水平和对照组差异无统计学意义（P>0.05）。见表1。

2.2UC治疗前后各组结肠黏膜TNF-α、IL-6及IL-2水平

治疗前，UC轻度组 [（TNF-α：t=68.616，P=1.530（10-34）；IL-6：t=3.205，P=3.196（10-3）]、UC中度组 [TNF-α：t=57.641，P=2.997（10-27）；IL-6：t=4.508，P=1.452（10-4）]、UC重度组[TNF-α：t=39.318，P=4.795（10-26）；IL-6：t=4.706，P=6.207（10-5）]。结肠黏膜TNF-α和IL-6水平明显高于对照组（P<0.05）；UC轻度组 [t=10.924，P=5.617（10-12）]、UC中度组[t=16.341，P=1.669（10-14）]和UC重度组 [t=19.983，P=4.158（10-18）]。结肠黏膜的IL-2明显低于对照组（P<0.05），随着严重程度增加，TNF-α[F=162.001，P=3.286（10-29）]和 IL-6 [F=60.278，P=7.906（10-17）]增高，IL-2[F=154.514，P=1.533（10-28）]降低，治疗后，UC组结肠黏膜TNF-α（F=1.341，P=0.265）、IL-6（F=0.391，P=0.760）及IL-2（F=1.638，P=0.185）水平和对照组差异无统计学意义（P>0.05）。见表2、附图。

2.3外周血和结肠黏膜的TNF-α、IL-6和IL-2间的关系及外周血 TNF-α、IL-6和 IL-2与Geboes的关系

外周血TNF-α分别与IL-6和IL-2呈正相关（r=0.733，P=0.009）和负相关（r=-0.674，P=0.017），IL-6和IL-2呈负相关（r=-0.615，P=0.032），结肠黏膜的TNF-α分别与IL-6和IL-2呈正相关（r=0.755，P=0.005）和负相关（r=-0.584，P=0.042），IL-6和IL-2呈负相关（r=-0.533，P=0.049）（P< 0.05），外周血TNF-α和IL-6分别与Geboes呈正相关（r=0.684，P=0.012；r=0.722，P=0.001），IL-2与Geboes呈负相关（r=-0.631，P=0.021）。

表1　UC治疗前后各组外周血TNF-α、IL-6和IL-2及Geboes指数比较 （ng/L，）

表1　UC治疗前后各组外周血TNF-α、IL-6和IL-2及Geboes指数比较 （ng/L，）

注：1）与对照组比较，P<0.05；2）与UC轻度组比较，P<0.05；3）与UC中度组比较，P<0.05

组别TNF-α IL-6 IL-2 Geboes对照组（n=25）81.43±51.52 9.82±1.75 24.53±5.21 0.51±0.16 UC轻度组（n=31）治疗前　126.51±42.631）　11.42±2.621）　19.62±4.381）　2.76±0.511）治疗后　82.61±53.69　10.25±2.41　25.64±4.96　1.49±0.75 UC中度组（n=25）治疗前　246.51±56.931）2）　13.67±2.981）2）　12.10±3.171）2）　3.55±0.631）2）治疗后　84.65±62.14　11.05±2.61　25.39±5.62　2.46±0.84 UC重度组（n=29）治疗前　436.92±105.411）2）3）　15.69±3.901）2）3）　7.12±2.061）2）3）　4.65±0.431）2）3）治疗后　93.96±67.77　11.18±2.97　26.48±5.30　2.84±0.29

2.4随访

随访3、6、12和24个月，UC复发者分别为1、3、3和4例，合计11例，外周血及病理组织检查均显示不同程度的TNF-α、IL-6和IL-2表达异常，治疗的Geboes均>3.1。失访者分别为1、2、1和2例，复发率分别为1.19%（1/84）、3.66%（3/82）、3.70%（3/81）和5.06%（4/79），合计复发率为13.90%，失访率合计为7.06%。

表2　UC治疗前后各组结肠黏膜TNF-α、IL-6及IL-2水平 （ng/L，10-1，）

表2　UC治疗前后各组结肠黏膜TNF-α、IL-6及IL-2水平 （ng/L，10-1，）

注：1）与对照组比较，P<0.05；2）与UC轻度组比较，P<0.05；3）与UC中度组比较，P<0.05

组别TNF-α IL-6 IL-2对照组（n=25）1.33±0.09 1.24±0.76 5.23±0.89 UC轻度组（n=31）治疗前　3.26±0.421）2.99±0.091）　1.76±0.441）治疗后　1.36±0.10　1.29±0.52　5.59±0.82 UC中度组（n=25）治疗前　3.65±0.181）2）　2.13±0.631）2）　2.15±0.311）2）治疗后　1.37±0.12　1.35±0.62　5.67±0.75 UC重度组（n=29）治疗前　4.01±0.331）2）3）　3.06±0.311）2）3）　1.76±0.271）2）3）治疗后　1.39±0.13　1.39±0.54　5.65±0.79

附图　结肠黏膜的TNF-α、IL-6和IL-2表达 （×200）

3　讨论

UC的最大特点就是发作和缓解反复交替，其病因与发病机制目前尚不清楚，早期认为UC发病涉及系统免疫功能紊乱，肠道黏膜的免疫功能异常，近些年进一步的研究显示，细胞因子参与免疫反应与炎症过程，导致持续肠道感染和肠黏膜屏障受损。既往我国着重强调控制症状，即所谓的“临床缓解”，2007年以后，大量学者呼吁需设立新的治疗目标，尽快诱导并维持长期缓解，黏膜愈合，防止并发症以改善患者生活质量，因此“黏膜愈合”作为评价疗效的重要提法延续至今[6]。但越来越多的文献报道，达到“黏膜愈合”标准的UC患者仍然会出现腹痛、腹泻和黏液便等肠易激综合征样症状，理论与实践的矛盾进一步证实了所谓的黏膜愈合部位可能还存在低度炎症反应，从而导致肠易激综合征样症状的发生和持续[7]。因此解决并解释该矛盾对于UC的临床临床治疗大有裨益。

TNF-α主要由激活的巨噬细胞及单核细胞所分泌的促炎细胞因子，在炎症性肠病发病中起主要作用，参与引起肠道黏膜损伤的机制有[8-9]：①通过促进血小板活化因子的释放，生成白三烯和氧自由基，TNF-α在与炎症性细胞作用后还可以加重肠黏膜损伤作用；②诱导合成NO，NO可引起肠黏膜细胞的损伤，导致UC固有膜内小血管形成不同程度的微小血栓，破坏肠道黏膜的微循环而加重肠道缺血缺氧状态。作为一种多向性的细胞因子，IL-6是由巨噬细胞及T细胞产生，可通过激活NK-κB，促进细胞间黏附分子表达，诱导UC患者体内的中性粒细胞和上皮细胞的相互作用，诱导肝细胞生成急性期蛋白，尤其在过度表达时，常导致机体内环境紊乱，影响肠上皮细胞电解质分泌特性，使内皮细胞肿胀，通透性增强，使黏附在内皮细胞的中性粒细胞涌出则加重炎症程度[10-11]。IL-2作为淋巴因子，具有多种生物学活性，在免疫调节方面具有重要意义，IL-2可与T、B及单核细胞表面的IL-2受体结合，引起T细胞活化和增殖，增强NK细胞活性，促进T细胞的杀伤作用和促进B细胞分泌等免疫反应。因此IL-2从侧面可反映T淋巴细胞活化程度和免疫系统清除自身衰老变性细胞的能力[12-13]。

本课题结果显示TNF-a、IL-6和IL-2在外周血和结肠黏膜水平与UC严重程度密切相关，前两者呈正相关，后者呈负相关，说明TNF-a、IL-6和IL-2参与了UC的发生发展，与病变严重程度密切相关，该结果与大量文献报道一致[14]。另一方面，UC患者治疗前外周血和结肠黏膜的TNF-a、IL-6和IL-2水平明显偏离正常范围，治疗后，3者均回复至正常，且治疗后的检查结果显示，Geboes评分<3.1，即黏膜上皮不存在中性粒细胞浸润，不伴有隐窝破坏或糜烂，达到“黏膜愈合”。且随访2年，合计复发率为13.90%，类似的结果BESSISSOW[5]也研究获得，与Geboes评分<3.1比较，Geboes评分≥3.1分的UC患者随访的1年复发率达37%，而前者的复发率为9%，如本课题中随访复发者多为Geboes评分≥3.1分，可见持续存在的低度炎症反应可促使“黏膜愈合”的UC患者复发。李炎摘[15]等人研究了近50%UC患者的肠道黏膜组织中存在不同程度的炎症改变，TNF-a、IL-6和IL-2水平异常，结合本课题结果，也从侧面验证了外周血和结肠黏膜的TNF-a、IL-6和 IL-2正常态与 Geboes评分≥3.1分也存在相关性。

本课题的问题与建议：首先，TNF-a、IL-6和IL-2作为重要的炎症因子指标，本课题也得到上述3个炎症因子在外周血和结肠黏膜的一致性变化，以及3个炎症因子与Geboes评分的线性关系，因此有必要扩大样本地确证外周血TNF-a、IL-6和IL-2与Geboes评分<3.1的关联度；进一步，因存在个体差异，TNF-a、IL-6和IL-2正常阈值需要大数据支持，本课题纳入样本量过少，可能存在偏差而难以推而广之。

综上，本研究结果提示外周血及肠黏膜TNF-a、IL-6和IL-2与UC严重程度关系密切，有助于与判断低度炎症反应的存在，有益于评估“黏膜愈合”和预后。

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（张蕾编辑）

Changes of TNF-a，IL-6 and IL-2 in peripheral blood and colonic mucosa of ulcerative colitis patients*

Li Li,Wei-wen Yang,Song Tan,Zheng-yong Liu,Tian-lan He,Zhen-yuan Dai
（Department of Gastroenterology，the Second People's Hospital of Guiyang，Guiyang，Guizhou 550081，China）

Objective To investigate the changes of TNF-a，IL-6 and IL-2 in peripheral blood and colonicmucosa in ulcerative colitis（UC）patients and their significance.M ethods Eighty-five UC patients in our hospital from January 2008 to January 2013 were collected and divided into 3 groups：mild group with 31 cases，moderate group with 25 cases and severe group with 29 cases.Twenty-five healthy people having normal colonoscopic results were collected as control group.TNF-α，IL-6 and IL-2 in peripheral blood and colonic mucosa of all subjects were detected and compared before and after treatment.Results Before treatment，compared with the control group，TNF-α and IL-6 in peripheral blood and colonic mucosa were significantly increased（P＜0.05）while IL-2 significantlydecreased by a severity-dependent manner in all the UC groups（P＜0.05）.After treatment，there was no significant difference in TNF-α，IL-6 or IL-2 of peripheral blood and colonic mucosa between the UC groups and the control group（P＞0.05）.Peripheral blood and colonic mucosa TNF-α and IL-6，TNF-α and Geboes，IL-6 and Geboes were in positive linear relationships（P＜0.05）.TNF-α and IL-2，IL-6 and IL-2，IL-2 and Geboes were in negative linear relationships（P＜0.05）.All patients accepted 3，6，12 and 24 months of follow-up；but 1，2，1 and 2 cases failed to be followed up in the respective period；UC recurrence was found in 1，3，3 and 4 cases respectively with the relapse rate of 1.19%（1/84），3.66%（3/82），3.70%（3/81）and 2.53%（3/79）respectively.The total recurrence rate was of 10.59%.Conclusions Peripheral blood and colonic mucosa TNF-α，IL-6 and IL-2 are correlated with the severity of UC.Assessing TNF-a，IL-6 and IL-2 can help to determine mucosal healing of UC.

ulcerative colitis；TNF-a；IL-6；IL-2

R 574.62文献标示码：A

10.3969/j.issn.1005-8982.2016.14.009

1005-8982（2016）14-0042-06

2015-12-12

贵阳市科技计划项目（No：20141001）

杨卫文，E-mail：LiLiyww@126.com；Tel：13985153026