葡萄籽原花青素对自发性高血压大鼠主动脉重构的改善作用研究*

黄霜枝，王晓玲，张先杰，陈燕玲，唐剑涛，靳俊峰，吴秀香

（遵义医学院珠海校区 1.病理学与病理生理学教研室，2.计算机教研室，广东 珠海 519041）

论著

葡萄籽原花青素对自发性高血压大鼠主动脉重构的改善作用研究*

黄霜枝1，王晓玲1，张先杰1，陈燕玲1，唐剑涛2，靳俊峰1，吴秀香1

（遵义医学院珠海校区 1.病理学与病理生理学教研室，2.计算机教研室，广东 珠海 519041）

目的探讨葡萄籽原花青素（GSP）对自发性高血压大鼠（SHR）主动脉重构的改善作用。方法8周龄雄性SHR 24只随机分为4组，每组6只：SHR组、GSP低剂量（50mg/kg）、高剂量组（200mg/kg）以及卡托普利组（30mg/kg）。6只同龄雄性W istar-Kyoto大鼠设为对照组。每周测定尾动脉收缩压（SBP）；治疗6周后HE染色下测定胸主动脉中膜横截面积（MCSA）、管腔面积（LA）及MCSA/LA；M asson三色法测量胸主动脉胶原容积分数（CVF）；ELISA法测定胸主动脉中Ⅰ型胶原（ColⅠ）含量；生化法检测大鼠胸主动脉中过氧化氢酶（CAT）活力及丙二醛（MDA）含量；蛋白免疫印迹法（W estern blot）检测胸主动脉中ERK1/2蛋白表达。结果GSP能显著降低SHR SBP（P<0.01），改善血管重构参数，减少胸主动脉MDA含量以及ERK1/2蛋白的表达，提高CAT活力。结论GSP能够改善SHR胸主动脉重构，其作用可能是通过降压、对抗氧化应激和抑制ERK1/2蛋白表达实现的。

葡萄籽原花青素；自发性高血压大鼠；重构；氧化应激；ERK1/2中国分类号：R 544.1；R 282.71

A

高血压病这一常见的心血管疾病发展至一定阶段会导致血管重构的发生，主要表现为血管平滑肌增殖肥厚及细胞外基质沉积，是造成动脉粥样硬化、心脑血管疾病及肾损害等并发症的病理基础[1]。因此，预防和改善血管重构在治疗高血压病中意义重大。本研究室前期实验观察到葡萄籽原花青素（grape seed procyanidin，GSP）具有降低肾性高血压大鼠血压，改善血管内皮细胞功能及血管重塑的作用[2-4]，该研究采用自发性高血压大鼠（spontaneously hypertensive rats，SHR）为研究对象，进一步探讨GSP对SHR胸主动脉重构的作用及机制，为使GSP成为防治高血压病的理想药物提供新的实验依据。

1　材料与方法

1.1实验材料

1.1.1动物SPF级雄性8周龄SHR大鼠24只，同周龄雄性（Wistar-kyoto，WKY）大鼠6只，体重180～200 g，由北京维通利华实验动物技术有限公司提供，许可证号：SCXK（京）2012-0001。

1.1.2药物与试剂GSP由天津尖峰天然产物研究开发有限公司惠赠，纯度≥95%，卡托普利（captopril）为中美上海施贵宝制药有限公司产品，Ⅰ型胶原（Collagen typeⅠ，ColⅠ）酶联免疫检测试剂盒、过氧化氢酶（Catalase，CAT）、丙二醛（Malondialdehyde，MDA）及Masson染色试剂盒均购自南京建成生物工程研究所，兔抗鼠细胞外调节蛋白激酶1/2（extracellular regulated protein kinases1/2，ERK1/2）及辣根过氧化物酶标记的羊抗兔Ⅱ抗购自Abcam公司，BCA蛋白质定量试剂盒购自武汉博士德生物工程有限公司。

1.1.3主要仪器蛋白电泳仪（Bio-Rad公司），大鼠尾动脉压测定装置、多道生理信号采集处理系统RM6240型（成都仪器厂）。

1.2实验方法

1.2.1动物分组与给药24只SHR随机分为4组：SHR组、低剂量GSP组、高剂量GSP组及卡托普利组，每组6只；6只WKY大鼠为对照组。用药组大鼠每日灌胃给药1次，分别为：GSP 50mg/kg和200 mg/kg、卡托普利30mg/kg；对照组及SHR组给予等量蒸馏水灌胃。每次灌胃2m l，连续灌胃6周。

1.2.2大鼠尾动脉收缩压（systolic pressure，SBP）的测定采用tail-cuff测压法，用大鼠无创尾动脉压测定装置和多通道生理信号采集处理系统进行检测，每周测压1次。

1.2.3胸主动脉重构形态学指标测定取大鼠主动脉弓下1 cm处胸主动脉0.5 cm，10%甲醛固定，常规石蜡包埋、切片（厚度为4μm），行HE染色，光学显微镜下放大400倍观察，用Image pro-plus 6.0图像分析软件分别测定并计算胸主动脉中膜横截面积（media cross-sectional area，MCSA）、管腔面积（lumen area，LA）和MCSA/LA。

1.2.4胶原定性和半定量分析石蜡切片进行Masson染色，用Image pro-plus 6.0图像分析软件计算出胶原容积分数（collagen volume fraction，CVF）（%）=主动脉胶原面积/所测视野面积×100%。

1.2.5ColⅠ含量测定取大鼠胸主动脉制备10%匀浆液，严格按照试剂盒说明书操作。

1.2.6MDA和CAT的测定将大鼠胸主动脉组织制成10%的组织匀浆液，4℃、12 000 r/min离心5 min后取上清液，严格按照试剂盒说明书操作。

1.2.7总蛋白的提取和蛋白免疫印迹法（Western blot）检测ERK的蛋白表达取大鼠胸主动脉制成10%组织匀浆液，加入等体积的2×上样缓冲液，煮沸10min使蛋白变性，12 000 r/min 4℃离心5 min取上清液，BCA法测定样品的蛋白浓度。进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，半干转印至硝酸纤维素膜上，经牛血清白蛋白BSA封闭、洗膜后加抗ERK抗体（1︰1 000）4℃孵育过夜，洗膜后加二抗（1︰15 000）37℃摇床孵育60min，洗膜，加ECL发光显色剂，暗盒压片、曝光、显影、定影于胶片。胶片经拍照后，用Image J图像分析软件进行灰度值分析，以实验各组吸光蛋白条带平均值与同一样品中内参条带的平均值比值作为蛋白的相对含量。

1.3统计学方法

采用SPSS 16.0统计软件进行数据分析，计量资料以均数±标准差（）表示，多组间正态分布的计数资料比较用单因素方差分析（ANOVA），用LSD法进行组间均数的两两比较，P<0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1GSP对SHR SBP的影响

用药前，SHR组和3个用药组大鼠尾动脉SBP均较对照组明显升高；用药1周时，与SHR组比较，3个治疗组大鼠的此项指标均有所降低，但差异无统计学意义（除外卡托普利组）。用药2周时，与SHR组比较，高剂量GSP组和卡托普利组的此项指标均明显降低，用药3～6周，与对照组比较，SHR组大鼠尾动脉SBP明显升高；与SHR组比较，3个用药组大鼠SBP均明显下降。见表1。

2.2GSP对SHR胸主动脉重构形态学参数的影响

与对照组比较，SHR胸主动脉管壁增厚，管腔狭窄，MCSA和MCSA/LA明显增大（P=0.000），LA明显减小（P=0.000）；与SHR组比较，各用药组MCSA增大（P=0.01、0.004和0.000）和LA减小（P=0.047、0.000和0.000）的表现均有缓解，MCSA/LA增高的幅度下降（P=0.000）。见图1和表2。

2.3GSP对SHR胸主动脉胶原含量的影响

对照组大鼠胸主动脉平滑肌细胞间蓝色胶原纤维少，排列整齐，分布均匀。SHR组大鼠胸主动脉平滑肌束间见大量胶原纤维沉积，排列紊乱，CVF较WKY组明显升高；3个用药组大鼠上述情况均有所减轻（低剂量GSP组的CVF差异无统计学意义，P=0.061），以高剂量GSP组和卡托普利组作用显著（与低剂量组比较，P=0.000）。见图2和表3。

2.4GSP对SHR胸主动脉中ColⅠ含量的影响

灌胃6周后，SHR胸主动脉中ColⅠ的含量显著高于对照组；与SHR组比较，3个用药组大鼠的此项指标均有所降低，3组治疗效果差异无统计学意义。见表3。

2.5 GSP对SHR胸主动脉中MDA和CAT的影响

SHR胸主动脉中CAT的活性较对照组明显降低，而MDA含量显著升高；与SHR组比较，3个用药组大鼠胸主动脉中CAT的活性均升高，MDA含量降低，高剂量GSP组和卡托普利组的效果尤为显著。见表4。

2.6GSP对SHR胸主动脉中ERK1/2蛋白表达的影响

SHR组胸主动脉中的ERK1/2蛋白表达较对照组明显增多，与SHR组比较，3个用药组的此项指标均明显降低，以高剂量GSP组和卡托普利组的ERK1/2蛋白表达降低明显。见图3和表5。

表1　GSP对SHR SBP的影响 （n=6，）

表1　GSP对SHR SBP的影响 （n=6，）

注：1）与对照组比较，P=0.000；与SHR组比较，2）P=0.338；3）P=0.069；4）P=0.004；5）P=0.001；6）P=0.000；7）P=0.079；8）P=0.034

组别6周对照组　98.80±13.45　103.96±10.80　105.69±11.01　103.13±8.74　103.43±14.79　109.80±13.68　110.28±13.66 SHR组　161.26±8.901）　166.91±6.591）　173.69±4.721）　178.76±5.851）　183.62±6.781）　184.43±6.951）　187.44±9.281）低剂量GSP组　50　162.48±5.601）　162.34±5.722）　164.62±5.863）　163.03±3.874）　161.38±8.035）　158.38±11.116）154.08±11.166）高剂量GSP组　200　161.91±7.081）　157.89±4.817）　152.13±6.556）　147.43±4.806）　144.80±6.566）　135.61±5.836）　125.14±5.586）卡托普利组　30　158.75±9.71）　156.41±10.218）152.91±10.746）145.17±14.396）132.16±13.446）　125.62±5.496）　116.98±7.346）剂量/（mg/kg）治疗前SBP/mmHg治疗后SBP/mmHg 1周2周3周4周5周

图1　各组大鼠胸主动脉结构变化 （×40）

图2　GSP对SHR胸主动脉中胶原含量的影响 （×400）

表2　GSP对SHR胸主动脉重构形态学参数的影响（n=6，）

表2　GSP对SHR胸主动脉重构形态学参数的影响（n=6，）

组别MCSA/LA对照组　3.21±0.40　10.65±0.05　0.30±0.02 SHR组　3.89±0.17　7.47±0.14　0.52±0.01低剂量GSP组　50　3.65±0.51　8.15±0.04　0.45±0.01高剂量GSP组　200　3.61±1.12　9.16±0.57　0.39±0.02卡托普利组　30　3.32±2.65　9.02±1.20　0.34±0.02剂量/（mg/kg）MCSA（×105μm2）LA（×105μm2）

表3　GSP对SHR胸主动脉CVF和ColⅠ的影响（n=6，）

表3　GSP对SHR胸主动脉CVF和ColⅠ的影响（n=6，）

注：1）与对照组比较，P=0.000；与SHR组比较，2）P=0.061；3）P=0.039；4）P=0.000；5）P=0.002；6）P=0.213；与低剂量GSP组比较，7）P=0.000；8）P=0.001；9）P=0.159

组别Col I/（ng/mgprot）对照组　49.27±1.35　1.17±0.34 SHR组　66.59±1.131）　2.80±0.591）低剂量GSP组　50　65.06±0.422）　2.13±0.393）高剂量GSP组　200　53.03±0.794）7）　1.74±0.365）6）卡托普利组　30　51.60±0.204）7）　1.69±0.808）9）剂量/（mg/kg）CVF/%

图3　各组大鼠胸主动脉中ERK1/2蛋白表达

表4　GSP对SHR胸主动脉中MDA和CAT的影响（n=6，）

表4　GSP对SHR胸主动脉中MDA和CAT的影响（n=6，）

注：1）与对照组比较，P=0.000；与SHR组比较，2）P=0.024；3）P=0.011；4）P=0.000；与低剂量GSP组比较，5）P=0.000；6）P=0.003

组别CAT/（u/mg）对照组　9.06±0.36　18.89±0.40 SHR组　15.22±0.811）　8.16±1.061）低剂量GSP组　50　13.73±0.742）　9.49±0.193）高剂量GSP组　200　10.09±0.884）5）　16.46±0.514）5）卡托普利组　30　11.17±1.884）6）　15.74±1.404）5）剂量/（mg/kg）MDA/（nmol/mgprot）

表5　GSP对SHR胸主动脉中ERK1/2蛋白表达的影响（n=6，）

表5　GSP对SHR胸主动脉中ERK1/2蛋白表达的影响（n=6，）

注：1）与对照组比较，P=0.000；与SHR组比较，2）P=0.000；与低剂量GSP组比较，3）P=0.000；4）P=0.001

组别ERK1/2吸光度值/β-actin吸光度值对照组　0.493±0.006 SHR组　0.977±0.0151）低剂量GSP组　50　0.777±0.0152）高剂量GSP组　200　0.627±0.0162）3）卡托普利组　30　0.727±0.0122）4）剂量/（mg/kg）

3　讨论

血管重构是一个动态过程，包括平滑肌细胞、成纤维母细胞和内皮细胞的增殖、迁移及重组、胶原基质的沉积等。很多学者研究发现[5-7]，高血压时血流和压力模式的改变所造成的机械负荷可使主动脉发生肥厚性重构，病理特征为管壁增厚，管腔狭窄及胶原过度合成等。本实验结果显示，SHR胸主动脉管壁增厚，管腔狭窄，中膜横截面积增加，管腔面积变小，平滑肌肌束间胶原纤维增多，特别是ColⅠ含量增加，表明SHR的胸主动脉发生了重构。经GSP治疗后，上述血管重构指标减轻，说明GSP具有改善SHR胸主动脉重构的作用。

高血压血管重构的发生是由于长期血压升高，血管壁对管腔内压力、流量变化及血管壁损伤而导致的一系列适应性结构和功能改变[8]，在早期能对抗压力负荷，但长期的这种改变会造成心、脑及肾等靶器官的损伤。因此，对抗高血压血管重构最主要的措施就是降低血压[9]。本研究结果显示，GSP能显著降低SHR的SBP，提示GSP改善高血压主动脉重构的机制之一是其具有降压作用。

氧化应激与高血压病的发生发展密切相关。氧化应激时，一方面表现为体内有大量的活性氧（reactive oxygen species，ROS）蓄积，通过激活多种信号转导通路损伤血管内皮细胞和血管平滑肌细胞，促进血管平滑肌细胞增殖和肥厚，导致胶原沉积，进而使血管壁增厚管腔狭窄从而引起高血压血管重构的发生[9]。ROS主要由两种含氧的自由基组成，即超氧阴离子和羟自由基。MDA是脂质过氧化产物，通过测定其含量，可间接获知体内自由基产生多少。另一方面表现为机体内清除自由基的抗氧化系统功能减弱。CAT是体内主要清除过氧化氢的酶，其含量减少可导致过氧化氢积聚和羟自由基形成，从而使细胞发生不可逆的损伤，引发高血压的发生[10]。有研究表明[11]，血管外膜产生的CAT可以不依赖血压的改变，而部分通过抑制外膜派生的p38MAPK的磷酸化减轻AngⅡ诱导的血管重构。本实验发现，SHR胸主动脉中MDA含量增加且CAT活力降低，表明SHR体内有氧化应激的存在。GSP能降低SHR胸主动脉中MDA含量，提高CAT活力，提示其可通过对抗氧化应激，从而减轻高血压主动脉重构。

研究表明，细胞内的ROS可作为第2信使激活ERK信号通路进而促进炎症因子表达，加重氧化应激[12]，促进高血压血管重构的发生。有学者[13]在2K1C高血压模型上发现，大鼠动脉的重构伴有p-ERK1/2的表达增高，说明ERK1/2在血管重构中发挥重要作用。本研究结果显示，GSP可以降低SHR胸主动脉中ERK1/2的表达，提示GSP改善SHR主动脉重构的作用与抑制ERK1/2蛋白表达有关。

总之，本实验结果表明，GSP在降压的同时，亦可以通过降低血管组织中MDA含量和ERK1/2的蛋白表达，增强CAT的活力，以减轻高血压的主动脉重构。鉴于GSP具有多种药理活性，其抗高血压主动脉重构的其他机制有待进一步探讨。

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（张蕾编辑）

Effect of grape seed procyanidins on im proving aortic rem odeling in spontaneous hypertension rats*

Shuang-zhiHuang1，Xiao-lingWang1，Xian-jie Zhang1，Yan-ling Chen1，Jian-tao Tang2，Jun-feng Jin1，Xiu-xiang Wu1
（1.Department of Pathology and Pathophysiology；2.Department of Computer Science，Zhuhai Campus of Zunyi Medical College，Zhuhai，Guangdong 519041，China）

Objective To investigate the effect of grape seed procyanidins（GSP）on improving aortic remodeling in spontaneous hypertension rats（SHR）.Methods Twenty-four male SHRs（8-week old）were randomized into 4 groups with 6 in each group：SHR group，low-dose GSP and high-dose GSP groups（50 or 200mg/kg）and Captopril group（30mg/kg）.Meanwhile，6 Wistar Kyoto rats（8-week old）were served as control group.Tail systolic pressure was measured every week.After 6-week treatment，media cross-sectional area（MCSA），lumen area（LA）and MCSA/LA of thoracic aorta were calculated after HE staining.Collagen volume fraction（CVF）was examined by Masson staining.ELISA and biochemical techniques were performed to determine the type I collagen（Col I），malondiadehyde（MDA）and catalase（CAT）levels respectively.Western blot was used to detect the expression of ERK1/2 in thoracic aorta.Results GSP could significantly decrease tail systolic pressure（P＜0.01），improve vascular remodeling parameters，reduce MDA content and the expression of ERK1/2 in thoracic aorta（P＜0.05），but increase CAT activity（P＜0.05）after 6-week treatment.Conclusions GSP significantly improves thoracic aorta remodeling of SHR by lowering systolic pressure，inhibiting oxidative stress aswell as suppressing the expression of ERK1/2.

grape seed procyanidin；spontaneous hypertension rat；remodeling；oxidative stress；ERK1/2

10.3969/j.issn.1005-8982.2016.14.003

1005-8982（2016）14-0012-05

2016-02-02

贵州省优秀科技教育人才省长专项资金（No：黔省专合字【2012】91号）；贵州省科技计划课题（No：黔科合SY字【2012】3114）

吴秀香，E-mail：wxx64@sina.com；Tel：0756-7623357