miR-20a-5p通过调控细胞周期蛋白D1抑制肾小管上皮细胞增殖

公方晓　孙仁华　徐云祥　呼邦传浙江省人民医院重症医学科，浙江杭州　310014

论著

miR-20a-5p通过调控细胞周期蛋白D1抑制肾小管上皮细胞增殖

公方晓孙仁华徐云祥呼邦传
浙江省人民医院重症医学科，浙江杭州310014

目的观察miR-20a-5p对肾小管上皮细胞增殖的影响，并验证其对细胞周期蛋白D1（cyclin D1）的靶向调控作用。 方法使用LipofectamineTM2000脂质体将微小RNA（miRNA）转染入人肾小管上皮细胞HK-2，实验分为3组，miR-20a-5p组转染miR-20a-5p，对照组转染阴性对照miRNA，空白组未做任何转染。CCK-8实验检测转染后各组细胞的吸光度值，流式细胞术检测各组的细胞周期变化。Western blot检测各组细胞cyclin D1的蛋白表达情况。构建荧光素酶报告基因，内含cyclin D1的3'端非翻译区（3'UTR），双荧光素酶报告基因实验验证miR-20a-5p对3'UTR的直接结合作用。 结果MiR-20a-5p组在转染后48～120 h的吸光度值均低于对照组和空白组（P＜0.05），另外两组差异无统计学意义（P＞0.05）。转染后72 h，miR-20a-5p组处于G1期的比例为（63.89± 3.61）%，高于另外两组（P＜0.05），而另外两组差异无统计学意义（P＞0.05）。转染后48 h，miR-20a-5p组的cyclin D1蛋白表达减少（P＜0.05）。与阴性对照miRNA相比，miR-20a-5p能抑制荧光素酶的活性（P＜0.05）。结论miR-20a-5p能抑制肾小管上皮细胞的增殖，并将细胞阻滞在G1期，其可能机制是miR-20a-5p抑制cyclin D1的表达，cyclin D1是miR-20a-5p的直接靶基因。

细胞周期蛋白D1；细胞增殖；肾小管；微RNAs

［Abstract］Objective To observe the effect ofmiR-20a-5p's on the proliferation of human renal tubular epithelial cells and to verify its targeted regulation of cyclin D1.M ethods miRNAswere transfected into HK-2 cells（human renal tubular epithelial cell）by LipofectamineTM2000.Cellswere divided into three groups，themiR-20a-5p group transfected with miR-20a-5p，the negative control group transfected with negative control miRNA and the blank control group transfected with nomiRNAs.The absorbances of cells in each group after transfection were evaluated by Cell Counting Kit-8（CCK-8），the cell cycles of each group were assayed by flow cytometry.The protein expression of cyclin D1 in each group after transfection was detected via Western blot.A firefly luciferase reporter vector containing 3'UTR of cyclin D1 was created and the Dual-Luciferase Reporter Assay System was used to test the direct combination ofmiR-20a-5p and 3'UTR.Results The absorbances ofmiR-20a-5p group were lower than those of negative control group and blank control group at 48-120 h after transfection（P＜0.05），and there was no statistical difference between the other two groups（P＞0.05）.The percentage of G1stage inmiR-20a-5p group was（63.89±3.61）%at 72 h after transfection，higher than those of the other two groups（P＜0.05），and there was no statistical difference between the other two groups（P＞0.05）.The protein expression of cyclin D1 inmiR-20a-5p group was lower than that of the other two groups at 48 h after transfection（P＜0.05）.Compared with negative controlmiRNA，miR-20a-5p repressed the luciferase activity（P＜0.05）. Conclusion miR-20a-5p can inhibit the proliferation of human renal tubular epithelial cells and cause a delay in the G1-stage.Themechanism may bemiR-20a-5p can repress expression of cyclin D1 and cyclin D1 is the direct target gene ofmiR-20a-5p.

［Key words］Cyclin D1；Cell proliferation；Kidney tubules；microRNAs

急性肾损伤（acute kidney injury，AKI）是重症患者中的一种常见合并症，在ICU中的发病率约20%～60%，住院死亡率常超过25%，死亡率较高［1，2］。根据改善全球肾脏病预后组织（KDIGO）2012年临床实践指南［3］，AKI的定义为：48 h内血清肌酐上升≥26.5μmol/L；或7 d内血清肌酐上升至≥1.5倍基线水平；或连续6 h尿量＜0.5mL/（kg·h）。AKI的病理生理过程中，肾小管上皮细胞损伤是重要的病理性变化。细胞损伤后必然会带来细胞周期的激活和自身细胞的增殖修复。近年来，针对AKI的肾小管细胞损伤修复及细胞周期变化的研究是一大热点［4-7］。miRNA是一类负性调控信使RNA翻译的小RNA，其与包括AKI在内的几乎所有疾病的发生发展均有密切关系。本研究旨在探讨miR-20a-5p对肾小管上皮细胞增殖及细胞周期的影响，并揭示其对cyclin D1的靶向调控作用。现报道如下。

1　材料与方法

1.1一般材料

所用miRNA均由美国Dharmacon公司合成：hsamiR-20a-5p（5'-UAAAGUGCUUAUAGUGCAGGUAG-3'），阴性对照miRNA（5'-UCACAACCUCCUAGAAAGAGUAGA-3'）。人肾小管上皮细胞HK-2及人胚胎肾细胞293T购自美国模式培养物集存库（ATCC）。LipofectamineTM2000脂质体购自美国Invitrogen公司。细胞计数CCK-8（Cell Counting Kit-8）试剂盒购自日本同仁化学研究所。细胞周期检测试剂盒（内含碘化丙啶染色液、RNA酶）购自中国碧云天生物技术研究所。小鼠抗人cyclin D1抗体 （sc-20044）购自美国Santa Cruz公司。SDS-PAGE电泳凝胶配制试剂盒购自中国碧云天生物技术研究所。荧光素酶报告基因载体pMIR-REPORT购自美国Ambion公司。双荧光素酶报告基因检测试剂盒购自美国Promega公司。

1.2方法

1.2.1细胞培养 HK-2、293T细胞培养于含10%胎牛血清的高糖DMEM培养液中，培养条件为37℃、5% CO2的培养箱。每1～2天予以常规换液，待细胞长满80%培养瓶时予胰酶消化传代。取对数生长期的细胞进行实验。

1.2.2细胞转染 将HK-2细胞以5×105个/孔接种于6孔板中，整个转染过程按照LipofectamineTM2000脂质体说明书进行。实验设3组，转染miR-20a-5p的细胞为miR-20a-5p组，转染阴性对照miRNA的细胞为对照组，不转染miRNA的细胞为空白组。将脂质体与miRNA充分混合于无血清DMEM培养液，最终加入细胞孔后的miRNA浓度为50 nmol/L。转染6 h后PBS清洗细胞，于常规培养液条件下继续培养。

1.2.3CCK-8实验 将HK-2细胞以2000个/孔接种于96孔板，每孔使用100μL培养液。按照前述方法进行转染，分组情况相同。分别于转染后24 h、48 h、72 h、96 h、120 h进行检测实验。检测时每孔加入10 μLCCK-8溶液，摇匀后继续在培养箱内培养1 h，在酶联免疫检测仪于450 nm波长处检测吸光度值。以加入相同量细胞培养液和CCK-8溶液但没有细胞的孔作为校正参考。

1.2.4流式细胞术观察转染后的细胞周期差异将HK-2细胞接种于6孔板中，转染方法及分组同前。转染后72 h用胰酶将各孔细胞消化下来，转移到离心管中。1000 rpm离心5min，去除上清培养液，以预冷PBS清洗后再次离心，每管加入预冷70%乙醇，于4℃固定12 h。再次清洗离心后去除上清液，每管加入碘化丙啶和RNA酶混合液混匀，37℃避光温浴30min，后于流式细胞仪488 nm激发波长处检测红色荧光。使用流式仪自带软件分析DNA含量。

1.2.5Wes ternblot检测转染后cyclin D1蛋白表达情况 6孔板接种HK-2细胞，分组及转染方式同前。转染后48 h，使用RIPA裂解细胞，离心后移除上清液，BCA法测定蛋白浓度。根据SDS-PAGE凝胶试剂盒说明书配好分离胶及浓缩胶。将测好浓度的蛋白与上样缓冲液混合后煮沸变性5 min，以每孔道20μg蛋白于12%SDS-PAGE凝胶中电泳。电泳条件为60 V恒压下30min，后100 V恒压下至溴酚蓝到达分离胶底部。湿转法将蛋白转入PVDF膜，转膜条件为350mA 2 h。封闭液在室温下对PVDF膜封闭1 h，洗膜后加入cyclin D1抗体或β-actin抗体，4℃震荡摇匀过夜。洗膜后与辣根过氧化物酶标记的山羊抗小鼠抗体室温孵育2 h，再次洗膜后加入ECL试剂，在Bio-Rad凝胶成像仪下检测发光情况。用Quantity-one软件进行灰度分析，与内参（β-actin）的发光情况比较，得出cyclin D1蛋白的相对表达量。

1.2.6双荧光素酶报告基因实验查找Targetscan、DIANA microT等网站，明确cyclin D1能与miR-20a-5p相结合的3'UTR，设计引物，内含Spe I及Mlu I酶切位点，进行PCR扩增，回收得目的片段。上游引物为5'-GGACTAGTCTGTTGTAAGAATAGGCATTAA-3'，下游引物为5'-CGACGCGTTCATCCTGGCAATGTGAGAAT-3'。设计合成一对与miR-20a-5p完全互补的引物，内含有Spe I及Mlu I酶切位点，经过退火程序后得到阳性片段。上游引物为5'-GGACTAGTCTACCTGCACTATAAGCACTTTA-3'，下游引物为5'-CGACGCGTTAAAGTGCTTATAGTGCAGGTAG-3'。将上述两种片段分别行纯化、双酶切后连接入pMIRREPORT荧光素酶载体。将载体转化感受态大肠杆菌，提取质粒后将双酶切正确的质粒进行测序，最终得到含有3'UTR的荧光素酶报告基因和含有阳性序列的荧光素酶报告基因。

转染前将293T细胞以4×105个/孔接种于24孔板，将荧光素酶报告基因、海肾荧光素酶质粒pRL-TK、miRNA联合转染293T细胞，转染过程按照LipofectamineTM2000脂质体说明书进行。转染后48 h进行双荧光检测，用PLB裂解液裂解细胞，然后加入LAR II，于发光仪检测得到荧光值M1。加入Stop&Glo检测液，启动海肾荧光素酶检测反应，测得荧光值为M2，以M1/M2的值表示报告基因的荧光素酶活性。

1.3统计学方法

采用SPSS 17.0统计学软件进行统计分析，计量资料以均数±标准差（±s）表示，使用F检验进行方差齐性检验，多组资料比较使用单因素方差分析，组间两两比较使用LSD法，两组资料比较使用t检验，以P＜0.05为差异具有统计学意义。

2　结果

2.1CCK-8法检测m iR-20a-5p对HK-2细胞增殖的影响

转染后24 h，miR-20a-5p组、对照组、空白组的吸光度值的差异无统计学意义（P＞0.05）。转染后48～120 h，三组吸光度值的差异具有统计学意义，miR-20a-5p组的吸光度值均低于另外两组（P＜0.05），而另外两组的差异无统计学意义（P＞0.05）（表1），miR-20a-5p在转染后48～120 h抑制了HK-2的细胞增殖（图1）。

表1　转染后48～120 h各组细胞吸光度值比较（±s）

表1　转染后48～120 h各组细胞吸光度值比较（±s）

组别　各时间点吸光度值24 h　48 h　72 h　96 h　120 h miR-20a-5p组对照组空白组F值P值0.41±0.02 0.39±0.04 0.40±0.03 0.571 ＞0.05 0.55±0.04 0.80±0.07 0.75±0.04 31.200 ＜0.05 0.81±0.02 1.10±0.06 1.06±0.03 67.966 ＜0.05 1.17±0.03 1.74±0.04 1.69±0.07 186.598 ＜0.05 1.61±0.06 1.96±0.06 2.02±0.04 85.806 ＜0.05

2.2流式细胞术揭示m iR-20a-5p对细胞周期的影响

转染后72 h，流式细胞仪检测发现三组细胞处于G1期的比例具有差异，miR-20a-5p组、对照组、空白组的G1期细胞比例分别为（63.89±3.61）%、（44.18± 4.04）%、（46.08±2.49）%，差异有统计学意义（F=29.988，P＜0.05）。miR-20a-5p组的G1期比例高于另外两组（P＜0.05），而另外两组差异无统计学意义（P＞0.05），说明miR-20a-5p能使HK-2细胞阻滞于G1期。

图1　m iR-20a-5p组细胞在转染后48～120 h的吸光度值低于对照组和空白组

2.3Western blot发现m iR-20a-5p抑制cylcin D1的蛋白表达

使用β-actin作为内参蛋白，发现转染后48 h，miR-20a-5p抑制了cyclin D1蛋白的表达。miR-20a-5p组、对照组、空白组的蛋白相对表达量分别为（0.12±0.03）、（0.50±0.16）、（0.46±0.12），差异有统计学意义（F=9.280，P＜0.05）。miR-20a-5p组的蛋白相对表达量低于另外两组（P＜0.05），另外两组差异无统计学意义（P＞0.05）（图2）。

图2　m iR-20a-5p在转染后48 h抑制cyclin D1的蛋白表达

2.4双荧光素酶报告基因实验揭示m iR-20a-5p与cyclin D1信使RNA3’UTR的结合作用

设计与miR-20a-5p完全互补结合的阳性片段，构建含有阳性片段的荧光素酶报告基因（阳性载体），同时将含有miR-20a-5p结合序列的cyclin D1的3'UTR构建为荧光素酶报告基因。每次转染时均使用海肾荧光素酶质粒pRL-TK共转染，以其荧光值作为内参校正。

miR-20a-5p、阴性对照miRNA分别与cyclin D1报告基因共转染，miR-20a-5p组的相对荧光素酶活性低于另一组，两组的相对荧光素酶活性分别为（125.46±10.29）、（355.33±30.74），差异有统计学意义（t=-12.283，P＜0.05）（图3）。miR-20a-5p、阴性对照miRNA分别与阳性载体共转染时，miR-20a-5p组的相对荧光素酶活性也低于对照组，两组的相对荧光素酶活性分别为（57.34±5.38）、（339.99±17.56），差异有统计学意义（t=-26.655，P＜0.05）（图3）。由于阳性片段能与miR-20a-5p完全结合，且两者共转染时荧光素酶活性低于对照miRNA，说明miR-20a-5p与荧光素酶报告基因结合可以抑制其荧光素酶活性。所以，miR-20a-5p能抑制cyclin D1报告基因的荧光素酶活性，说明其与cyclin D1的3'UTR可以直接结合。结果表明，cyclin D1是miR-20a-5p的直接靶基因。

图3　m iR-20a-5p能抑制阳性片段载体及cyclin D1报告基因的荧光素酶活性（*P＜0.05）

3　讨论

在临床实践中，AKI的病因主要有缺血、心脏大手术、药物损害、脓毒症［8-10］。AKI的病理生理过程较为复杂，包括肾脏灌注压下降、肾小球滤过率（GFR）下降、微循环障碍、内皮细胞损伤等，但如果病因不能去除的话，AKI最终会导致肾小管上皮细胞的损伤、坏死或凋亡［11-13］。目前有研究提示发生AKI时，正常的处于静止期的上皮细胞可重新进入细胞周期，进行分裂增殖，而非一些干细胞重新增殖分化成新的细胞［14，15］。从此机制来看，肾小管细胞进入细胞周期增殖，对AKI的恢复具有治疗意义。但近来的一些研究对这一看法提出了挑战。Pabla等［16］在顺铂诱导AKI小鼠模型中发现，细胞周期蛋白依赖激酶4/6（CDK4/6）明显激活，CDK6表达增加；CDK6抑制剂palbociclib和ribociclib能诱导细胞周期阻滞，但同时减轻AKI，改善AKI小鼠的生存预后。CDK抑制因子p21能与几乎所有的Cyclin-CDK复合物结合，包括cyclin D-CDK4/6、cylin E-CDK2，过表达p21能抑制他们的活性，造成细胞周期阻滞在G1期。Price等［17］发现敲除p21基因的AKI小鼠其形态学损伤更严重，AKI病情进展更迅速，死亡率更高。抑制细胞周期能改善AKI的具体机制尚不清楚，有待进一步研究。

微小RNA（miRNA）是一种22个核苷酸左右的小RNA，其不具有翻译功能，而是调控信使RNA的翻译。miRNA与信使RNA的3'端非翻译区（3'UTR）结合，依靠一些酶类造成信使RNA降解或抑制其翻译成蛋白质［18-20］。miRNA在很多疾病中的表达发生变化，异常表达的miRNA通过调控不同的靶基因对疾病的发生发展产生影响。本研究将miR-20a-5p转染入正常人肾小管上皮细胞HK-2，CCK-8实验发现在转染后2～5 d，细胞生长受到抑制。随后我们用流式细胞仪检测转染后的细胞，发现miR-20a-5p使细胞处于G1期的比例明显增加。说明miR-20a-5p通过细胞阻滞于G1期来抑制HK-2的生长。为了探讨其中的机制，我们查找Targetscan、DIANAmicroT等靶基因预测网站，发现cyclin D1是miR-20a-5p的潜在靶基因。我们使用Western blot证实miR-20a-5p可以抑制cyclin D1的蛋白表达，双荧光素酶报告基因实验证实miR-20a-5p能直接与cyclin D1的3'UTR相结合。说明miR-20a-5p能与cyclin D1的mRNA直接结合，cyclin D1是miR-20a-5p的靶基因。

cyclin D1受到生长因子刺激在G1期早期就开始合成，其与CDK4/6结合，激活它们的活性，进而磷酸化Rb蛋白，磷酸化的Rb蛋白能使转录因子E2F释放出来，启动靶基因转录，促进细胞从G1期进入S期［21，22］。cyclin D1对细胞周期存在正向推动作用，本研究证实miR-20a-5p能在肾小管细胞中抑制cyclin D1的表达，进而抑制细胞周期进展。因此我们的研究为miR-20a-5p在AKI治疗中的应用前景提供了一定依据，当然，这还需进一步深入研究。另外Wang等［23］发现在缺血所致AKI小鼠模型中，miR-20a-5p在发生AKI的肾脏中表达下降，并能影响肾小管细胞的自噬。Zhou等［24］发现在大鼠发生AKI时，其肾脏中cyclin D1的表达是上升的。我们的研究说明cyclin D1是miR-20a-5p的靶基因，所以cyclin D1过表达可能与miR-20a-5p的低表达相关，提示miR-20a-5p 与cyclin D1对AKI的进展具有一定的作用。

综上所述，miR-20a-5p能将肾小管上皮细胞阻滞在G1期，从而抑制肾小管上皮细胞的增殖复制。其机制为miR-20a-5p抑制cyclin D1表达，而cyclin D1被证实为miR-20a-5p的直接靶基因。

［1］Bouchard J，Acharya A，Cerda J，et al.A prospective internationalmulticenter study of AKI in the intensive care unit［J］.Clin JAm Soc Nephrol，2015，10（8）:1324-1331.

［2］Hoste EA，Bagshaw SM，Bellomo R，et al.Epidemiology ofacute kidney injury in critically ill patients：Themultinational AKI-EPIstudy［J］.Intensive Care Med，2015，41（8）：1411-1423.

［3］Khwaja A.KDIGO clinical practice guidelines for acute kidney injury［J］.Nephron Clin Pract，2012，120（4）：c179-c184.

［4］Meersch M，Schmidt C，Van Aken H，et al.Validation of cell-cycle arrest biomarkers for acute kidney injury after pediatric cardiacsurgery［J］.PLoSOne，2014，9（10）：e110865.

［5］Endre ZH，Pickering JW.Acute kidney injury：Cell cycle arrest biomarkers win race for AKI diagnosis［J］.Nat Rev Nephrol，2014，10（12）：683-685.

［6］Iwakura T，Fujigaki Y，Fujikura T，et al.Acquired resistance to rechallenge injury after acute kidney injury in rats is associated with cell cycle arrest in proximal tubule cells［J］.Am JPhysiol Renal Physiol，2016，310（9）：F872-F884.

［7］Bell M，Larsson A，Venge P，et al.Assessment of cell-cycle arrest biomarkers to predict early and delayed acute kidney injury［J］.Dis Markers，2015，2015：158658.

［8］李源，王欣，杨贵博，等.冠状动脉旁路移植术后急性肾损伤的危险因素分析［J］.标记免疫分析与临床，2015，22 （10）：978-981.

［9］胡健，尚为明，王锋.CRRT在脓毒血症急性肾损伤患者救治中的临床研究［J］.标记免疫分析与临床，2015，22 （8）：784-788.

［10］AzzaliniL，SpagnoliV，Ly HQ.Contrast-induced nephropathy：From pathophysiology to preventive strategies［J］.Can JCardiol，2016，32（2）：247-255.

［11］Molitoris BA.Therapeutic translation in acute kidney injury：The epithelial/endothelialaxis［J］.JClin Invest，2014，124（6）：2355-2363.

［12］Keir I，Kellum JA.Acute kidney injury in severe sepsis：Pathophysiology，diagnosis，andtreatment recommendations［J］.JVet Emerg Crit Care，2015，25（2）：200-209.

［13］Kanagasundaram NS.Pathophysiology of ischaemic acute kidney injury［J］.Ann Clin Biochem，2015，52（2）：193-205.

［14］Kusaba T，LalliM，Kramann R，etal.Differentiated kidney epithelial cells repair injured proximal tubule［J］.Proc Natl Acad Sci USA，2014，111（4）：1527-1532.

［15］Humphreys BD，Czerniak S，DiRocco DP，et al.Repair of injured proximal tubule does not involve specialized progenitors［J］.Proc Natl Acad SciUSA，2011，108（22）：9226-9231.

［16］Pabla N，Gibson AA，Buege M，et al.Mitigation of acute kidney injury by cell-cycle inhibitors that suppress both CDK4/6 and OCT2 functions［J］.Proc Natl Acad Sci USA，2015，112（16）：5231-5236.

［17］Price PM，Safirstein RL，Megyesi J.The cell cycle and acute kidney injury［J］.Kidney Int，2009，76（6）：604-613.

［18］邬振华，李群，崔翔，等.miR-196a在下咽鳞状细胞癌血浆中的表达及其临床意义［J］.中国现代医生，2015，53（3）：11-15.

［19］钟克波，张鹏，何晓顺，等.肝移植术后稳定生存者外周血中差异表达miRNA及其功能预测［J］.南方医科大学学报，2015，35（11）：1557-1563.

［20］Singh Y，Garden OA，Lang F，et al.MicroRNA-15b/16 enhances the induction of regulatory T cells by regulating the expression of rictor and mTOR［J］.J Immunol，2015，195（12）：5667-5677.

［21］王平，刘珊，程波，等.子宫颈上皮内瘤变及鳞状细胞癌组织cyclin D1表达特征及其与HPV16 E7表达的相关性分析［J］.中华病理学杂志，2015，44（12）：884-888.

［22］官文俊，许臣洪.AMPK激动剂AICAR通过阻滞细胞周期于G0/G1期抑制肺动脉平滑肌细胞增殖［J］.医学研究杂志，2015，44（5）：111-113

［23］Wang IK，Sun KT，Tsai TH，et al.MiR-20a-5p mediates hypoxia-induced autophagy by targeting ATG16L1 in ischemic kidney injury［J］.Life Sci，2015，136：133-141.

［24］Zhou H，Kato A，Yasuda H，et al.The induction of cell cycle regulatory and DNA repair proteins in cisplatininducedacuterenalfailure［J］.ToxicolApplPharmacol，2004，200（2）：111-120.

miR-20a-5p inhibits proliferation of renal tubular epithelial cells by targeting cyclin D1

GONG FangxiaoSUN RenhuaXU YunxiangHU Bangchuan
Department of Intensive Care Unit，Zhejiang Provincial People's Hospital，Hangzhou310014，China

R737.11

A

1673-9701（2016）20-0001-05

浙江省科学技术厅省级重点科技创新团队项目

（2011R50018-09）

2016-04-06）