女性非吸烟肺腺癌患者癌组织中miR-93-3p表达与EGFR突变的关系

王玉，张寰，许芳秀，俞晓，林虹燕，钱碧云,

(1天津医科大学肿瘤医院，国家肿瘤临床研究中心，天津市肿瘤防治重点实验室，天津300060；2中国人民解放军第401医院；3上海交通大学公共卫生学院)



女性非吸烟肺腺癌患者癌组织中miR-93-3p表达与EGFR突变的关系

王玉1，张寰1，许芳秀2，俞晓3，林虹燕3，钱碧云1,3

(1天津医科大学肿瘤医院，国家肿瘤临床研究中心，天津市肿瘤防治重点实验室，天津300060；2中国人民解放军第401医院；3上海交通大学公共卫生学院)

目的探讨女性非吸烟肺腺癌患者癌组织中表皮生长因子受体(EGFR)突变与miR-93-3p表达的关系。方法选择女性非吸烟肺腺癌患者149例，利用实时荧光定量PCR方法检测其中112例肺腺癌组织中miR-93-3p的相对表达量，应用直接测序方法检测149例肺腺癌组织中EGFR的突变情况；分析miR-93-3p表达与临床病理特征、EGFR突变及预后的关系。结果肺腺癌组织中miR-93-3p的相对表达量与临床分期有关。149例患者中，EGFR野生型78例，突变型71例；EGFR突变型患者的miR-93-3p表达高于野生型患者(P<0.01)。miR-93-3p高表达患者的预后较miR-93-3p低表达者差，但差异无统计学意义(P>0.05)。分层分析显示，年龄≤60岁的女性患者中，miR-93-3p高表达者预后较低表达者差(P<0.05)。结论EGFR突变患者miR-93-3p表达升高；miR-93-3p可能成为女性非吸烟肺腺癌靶向治疗的新靶点，尤其是年轻女性。

非小细胞肺癌；女性；烟草，非吸烟；表皮生长因子受体；miR-93-3p

肺腺癌是女性非吸烟肺癌患者的主要病理类型[1]。既往研究显示，女性非吸烟肺腺癌患者癌组织中的表皮生长因子受体(EGFR)具有较高的突变率[2]。EGFR酪氨酸激酶抑制剂(EGFR-TKI)具有给药方式简便、高特异性、无严重不良反应等优点，是肺癌的主要治疗手段，但仍有20%～30%的EGFR突变型肺癌患者使用EGFR-TKI无效[3]。微小核糖核酸(miRNA)是一类内源性长度为18～25 nt的单链非编码RNA，它能调控大约50%的编码蛋白基因，参与调控肺癌的发生发展过程[4]。研究表明，miR-23a、miR-134在不同EGFR突变中的表达谱存在差异，与EGFR-TKI的治疗效果有关。我们的前期研究对4例女性非吸烟肺腺癌患者进行观察，发现miR-93-3p在EGFR突变型和EGFR野生型中的表达存在差异[5]。本研究进一步扩大样本量，检测了149例女性非吸烟肺腺癌患者EGFR的突变状况及女性非吸烟肺腺癌患者癌组织中miR-93-3p的表达，探讨miR-93-3p表达与EGFR突变、临床病理特征及预后的关系。

1　资料与方法

1.1临床资料选取2007年1月～2013年12月天津肿瘤医院收治的女性非吸烟肺腺癌患者149例，年龄28～81岁、平均59岁。均经手术病理或组织活检确诊为原发性肺腺癌。既往无恶性肿瘤史，术前未进行新辅助放化疗。患者术后每半年经电话随访一次，末次随访时间为2014年2月。失访患者的生存时间截止到最后一次随访时间，死亡患者的生存时间截止到死亡时间，仍存活患者的生存时间截止到末次随访时间。

1.2EGFR突变检测用酚-氯仿方法提取149例肺腺癌组织DNA。通过PCR方法扩增EGFR的4个外显子，目的片段PCR产物根据Ezgene Gel/PCR extraction Kit(BIOMIGA公司，美国)说明书进行纯化，通过BigDye测序反应试剂盒(Applied Biosystems公司,美国)对纯化产物进行测序分析。测序PCR反应体系如下：2.5×BigDye 0.25 μL，5×BigDyeSeq Buffer 3.875 μL，3.2 pmol/μL引物1 μL，10 ng/μL纯化后PCR产物1 μL，灭菌水13.875 μL，共20 μL。反应条件：96 ℃ 1 min；96 ℃ 10 s、55 ℃ 5 s、60 ℃ 4 min，25个循环。将测序PCR产物纯化后进行上样电泳，用Sequencing Analysis v5.4软件分析EGFR的突变情况。

1.3肺腺癌组织中miR-93-3p表达检测采用RT-PCR方法。取112例肺腺癌组织标本，使用Trizol试剂提取总RNA，逆转录合成cDNA。实时荧光定量PCR反应的mix为Taqman universal Master MixⅡ,no UNG(Applied Biosystems公司,美国),miR-93-3p荧光探针由美国Sangon公司合成，反应体系：2×mix 2.5 μL, 20×probe 0.25 μL，cDNA 0.5 μL，DEPC水1.75 μL，共5 μL。反应条件：50 ℃ 2 min，95 ℃ 10 min，50个循环(95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min)。每个样本设3个复孔。以RNAU6为内参，目的基因miR-93-3p的相对表达量用lg2-ΔΔct表示：Δct=ctmiR-93-3p-ctRNAU6;ΔΔct=Δct-Δctmean。

2　结果

2.1肺腺癌组织中miR-93-3p表达与临床病理特征的关系见表1。

表1　肺腺癌组织中miR-93-3p表达与临床病理特征的关系

2.2miR-93-3p表达与EGFR突变的关系149例患者中，EGFR野生型78例；突变型71例，其中18外显子突变5例，19外显子突变27例，20外显子突变7例，21外显子突变32例。112例患者中，EGFR突变型肺腺癌组织中miR-93-3p的相对表达量为7.60±0.46，EGFR野生型为7.31±0.42，二者比较P<0.01。根据临床分期进行分层分析，Ⅰ、Ⅱ期EGFR突变型肺腺癌组织中miR-93-3p的相对表达量为7.55±0.07，高于EGFR野生型的7.24±0.07(P<0.01)；Ⅲ、Ⅳ期EGFR突变型的肺腺癌组织中miR-93-3p的相对表达量为7.61±0.09，高于EGFR野生型的7.35±0.07(P<0.05)。

2.3肺腺癌组织中miR-93-3p表达对肺癌预后的影响生存分析显示，临床分期是影响预后的因素(P<0.05)，而年龄、是否有肺部疾病史、是否有肿瘤家族史、EGFR突变状态与预后无关(P均>0.05)。根据miR-93-3p在肺腺癌组织中相对表达量的平均值7.46，将患者分为低表达组(相对表达量≤7.46)和高表达组(相对表达量﹥7.46)。Kaplan-Meier生存分析显示，与低表达组相比，高表达组预后较差，但无统计学意义(P=0.075)，见表2。进一步进行年龄分层分析显示，年龄≤60岁女性高表达组生存率较低表达组低(P<0.05)，年龄>60岁女性高表达组与低表达组生存率差异无统计学意义(P>0.05)，见图1。

表2　患者临床特征与预后的关系

3　讨论

研究显示，我国青年女性人群的肺腺癌发病率近年来呈持续上升趋势。本研究利用直接测序方法检测女性非吸烟肺腺癌患者癌组织中EGFR的突变情况，结果显示EGFR的突变率为47.66%，以19、21外显子突变最常见，与以往文献[6]报道一致。

EGFR是一种跨膜受体，由胞膜外配体结合区域、单跨膜区域以及具有酪氨酸激酶(TK)活性的胞质区构成。当酪氨酸激酶活性区域即18～21外显子区发生突变时，受体的酪氨酸激酶被活化，引起多个细胞内的信号级联反应，导致肿瘤的发生[7]。靶向药物EGFR-TKI通过与ATP竞争EGFR胞内区激酶催化位点，阻断酪氨酸激酶的活性，抑制肿瘤的生长，可显著延长患者生存期[8]。但是随着临床上的广泛应用，患者对其产生了耐药性。Yamamoto等[9，10]报道，PTEN表达的缺失和PIK3CA异常突变阻碍了EGFR-TKI诱导的肿瘤细胞凋亡，下调PTEN表达可促进肺癌细胞增殖。miRNA与EGFR-TKI的耐药机制相关。Li等[11]报道，miR-21在EGFR-TKI耐药性细胞株PC9GR中高表达，除此之外，miR-200a、miR-23a都被发现与EGFR-TKI耐药有关[12，13]。

图1　年龄分层分析miR-93-3p表达对肺腺癌生存率的影响

miR-93属于miR-106b-25基因家族，可通过抑制多个肿瘤相关蛋白的表达，调控肿瘤的发生发展过程。有研究表明，miR-93通过下调PDCD4的表达，抑制胃癌细胞的凋亡[14]。Lin等[15]研究发现，miR-93能够抑制抑癌基因FUS1的表达，促进肺癌细胞系H1299的增殖，起到癌基因的作用。除此之外，miR-93在肿瘤的耐药性机制中也发挥重要作用。另有研究表明,在卵巢癌和肝癌细胞中,miR-93通过调控PTEN/Akt通路影响肿瘤细胞的凋亡，继而引发耐药[16，17]。miR-93-3p是miR-93的一种亚型，能够调节细胞的增殖、凋亡，参与耐药机制的调控。Li等[18]研究发现，miR-93-3p参与鼻咽癌放疗耐受机制的调控。本研究利用实时荧光定量方法检测女性非吸烟肺腺癌患者癌组织中miR-93-3p的表达，结果发现其表达与临床分期有关，在Ⅲ+Ⅳ期肺腺癌中高表达。近年来女性非吸烟肺腺癌患者趋于年轻化，本研究显示，年轻女性中miR-93-3p高表达者预后不良，可能为其治疗提供新的靶点。以上结果表明miR-93在肺癌的发生发展过程中可能起到促癌基因的作用。进一步分析发现，miR-93-3p在EGFR突变的肺腺癌组织中高表达，提示其与EGFR-TKI的耐药机制有关。

综上所述，在EGFR突变的女性非吸烟肺腺癌患者癌组织中miR-93-3p高表达；在年轻女性患者中，miR-93-3p高表达的患者生存较差，其可能成为女性非吸烟肺腺癌靶向治疗的潜在靶点。

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Relationship between miR-93-3p expression and EGFR mutation in non-smoking female patients with lung adenocarcinoma

WANGYu1,ZHANGHuang,XUFangxiu,YUXiao,LINHongyan,QIANBiyun

(1TianjinMedicalUniversityCancerInstituteandHospital,Tianjin300060,China)

ObjectiveTo investigate the relationship between the mutation of epidermal growth factor receptor (EGFR) and the relative expression of miR-93-3p in lung adenocarcinoma tissues from non-smoking female patients.MethodsTotally 149 cases of non-smoking female patients with lung adenocarcinoma were selected. The expression levels of miR-93-3p in lung adenocarcinoma tissues from 112 cases of 149 patients were detected by real-time quantitative PCR. EGFR mutations were detected in 149 patients using DNA sequencing, and then we analyzed correlations of miR-93-3p expression with the clinicopathological features, EGFR mutation and prognosis.ResultsThe relative expression of miR-93-3p was associated with the clinical stage. The miR-93-3p EGFR mutations were found in 71 of 149 patients (47.65%). The relative expression of miR-93-3p in patients with EGFR mutations were higher than that of patients with wild type (P<0.01). There was no significant difference in prognosis between the patients with high and low expression of miR-93-3p, although the patients with high expression showed a poorer prognosis (P>0.05). Stratified analysis revealed that for patients younger than 60 years old, higher levels of miR-93-3 pexpression indicated worse prognosis (P<0.05). ConclusionThe expression of miR-93-3p is increased in patients with EGFR mutations, which suggests that miR-93-3p may be a new therapeutic target for the treatment of non-smoking female patients with lung adenocarcinoma, especially for young female ones.

non-small-cell lung cancer; female; tobacco, non-smoking; epidermal growth factor receptor; microRNA-93-3p

国家自然科学基金资助项目(81573231)；天津市自然科学基金资助项目(13JCYBJC23100)。

王玉(1991-)，女，硕士研究生在读，主要研究方向为肿瘤分子流行病学。 E-mail: yuwang9113@163.com

简介：钱碧云(1971-)，女，教授，主要研究方向为肿瘤分子与临床流行病学。E-mail: qianbiyun@126.com

10.3969/j.issn.1002-266X.2016.22.003

R734.2

A

1002-266X(2016)22-0008-04

2016-03-09)