1,25-二羟基维生素D3对高氧环境中肺腺癌细胞凋亡的影响及机制

张有辰，金正勇，许东元

(1延边大学附属医院,吉林延吉133000；2延边大学形态实验中心)



1,25-二羟基维生素D3对高氧环境中肺腺癌细胞凋亡的影响及机制

张有辰1，金正勇1，许东元2

(1延边大学附属医院,吉林延吉133000；2延边大学形态实验中心)

目的观察1,25-二羟基维生素D3[1,25(OH)2VitD3]对高氧环境中人肺腺癌A549细胞凋亡的影响，并探讨其机制。方法取对数生长期A549细胞，随机分为5组。A组于37 ℃、5% CO2饱和湿度培养箱中培养，不处理；B组于高氧环境中培养，不处理；C、D、E组于高氧环境中培养，并分别加入终浓度为0.1、1、10 μmol/L的1,25(OH)2VitD3处理48 h。流式细胞仪检测凋亡细胞数并计算细胞凋亡指数，Western blot法检测细胞中的Bcl-2、Bax蛋白。结果A、B、C、D、E组细胞凋亡指数分别为2.45±0.91、40.83±4.96、42.65±4.85、63.43±5.61、76.47±5.94，A组与其他四组比较P均<0.05，B、C组比较P>0.05,D、E组与B、C组比较P均<0.05，D、E组比较P<0.05。与A组比较，B、C、D、E组Bcl-2蛋白表达及Bcl-2/Bax值均下降，而Bax蛋白表达均增高，P均<0.05。B、C组Bcl-2、Bax蛋白表达及Bcl-2/Bax值比较，P均>0.05。与B、C组比较，D、E组Bcl-2蛋白表达及Bcl-2/Bax值下降，而Bax蛋白表达增高，P均<0.05。与D组比较，E组Bcl-2蛋白表达及Bcl-2/Bax值下降(P均<0.05)，而Bax蛋白表达变化不明显(P>0.05)。结论1,25(OH)2VitD3可促进高氧环境中肺腺癌A549细胞凋亡，可能与其调节Bcl-2/Bax平衡有关。

肺肿瘤；A549细胞；1,25-二羟基维生素D3；高氧；细胞增殖；细胞凋亡；Bcl-2蛋白；Bax蛋白

肺癌作为最常见的恶性肿瘤之一，居癌症死亡首位[1]。氧气吸入广泛应用于肺癌的治疗，高氧可迅速提高血氧含量，改善或纠正组织缺氧，防止或减轻缺氧性损害的发生、发展。研究表明，高氧可诱导乳腺癌、肺癌、结肠癌等多种肿瘤细胞的凋亡，增强肿瘤细胞对放化疗的敏感性[2]。近年研究发现，紫外线照射可促进维生素D合成，减少肺癌的发生率[3]。1,25-二羟基维生素D3[1,25(OH)2VitD3]作为固醇类激素，可从食物及药物中获取并被人体吸收利用。研究报道，1,25(OH)2VitD3能抑制肺腺癌细胞增生,调控细胞周期,促进细胞凋亡[4]。但1,25(OH)2VitD3对高氧环境中肺腺癌的细胞凋亡是否有影响，尚需进一步研究。2015年3月～2016年1月，我们观察了1,25(OH)2VitD3对高氧环境中肺腺癌A549细胞凋亡的影响，并探讨其可能的机制，为肺癌的综合治疗提供实验依据。

1　材料与方法

1.1材料1,25(OH)2VitD3购自美国Sigma公司，A549细胞由延边大学医学院形态学实验中心提供；Annexin V-FITC/PI试剂盒购自美国BD公司，流式细胞仪(BD FACSVerse公司)；凋亡调控相关抗体(Bcl-2，Bax)购自Santa Cruz公司，四甲基偶氮唑盐(MTT)购自GIBCO公司，DMEM/HIGH GLUCOSE培养液购自Thermo scientific公司，胎牛血清购自Thermo Fisher scientific公司，胰蛋白酶-EDTA消化液购自Solarbio公司，SDS-PAGE凝胶制备试剂盒购自Solarbio公司；紫外分光光度计(eppndorf BioPhotometer公司)，细胞培养箱(STIK公司)，电泳仪(BIO-RAD公司)。

1.2方法

1.2.1细胞培养及分组处理将A549细胞复苏后，于37 ℃、5% CO2饱和湿度培养箱中进行常规培养。取对数生长期细胞，随机分为5组，每组设9个平行复孔。A组仍于37 ℃、5%CO2饱和湿度培养箱中用含5%胎牛血清的DMEM培养液常规培养，不处理；B组于高氧培养箱(即向封闭培养箱内通入O2、CO2及N2混合气30 min，流量5 L/min，当测得氧浓度为80%～85%时封闭培养箱)中培养48 h，培养液同A组，不处理；C、D、E组于高氧培养箱中培养，待细胞融合至40%～50%，分别给予0.1、1、10 μmol/L的1,25(OH)2VitD3处理48 h。

1.2.2细胞凋亡检测采用流式细胞术。取各组细胞，加入胰蛋白酶-EDTA消化液，PBS洗涤。取100 μL的Binding Buffer悬浮细胞，加入5 μL Annexin V-FITC混匀，后加入5 μL的Propidium Iodide混匀，室温避光反应15 min，流式细胞仪检测凋亡细胞数。细胞凋亡指数=凋亡细胞数/总细胞数×100。以上步骤重复10次，取平均值。

1.2.3细胞Bcl-2、Bax蛋白检测采用Western blot法。取各组细胞，用胰蛋白酶-EDTA消化液消化，用PBS洗涤细胞2次。加入RIPA细胞裂解液和蛋白酶抑制剂，充分搅匀,离心抽提液；提取蛋白样本以8%聚丙烯酰胺凝胶进行还原性SDS-PAGE电泳,半干式转膜(PVDF膜),300 mA恒流40 min。封闭液封闭后，PVDF膜过夜；PBS-T缓冲液中充分振荡清洗，分别滴加Bcl-2、Bax蛋白一、二抗(稀释比例均为1∶2 000)；ECM显色，X线胶片显影、定影。将胶片进行扫描或拍照，用ImageJ2软件处理系统分析目标条带的灰度值，以此表示目的蛋白的表达量。以上步骤重复10次，取平均值。

2　结果

2.1各组细胞凋亡指数比较A、B、C、D、E组细胞凋亡指数分别为2.45±0.91、40.83±4.96、42.65±4.85、63.43±5.61、76.47±5.94，A组与其他四组比较P均<0.05，B、C组比较P>0.05,D、E组与B、C组比较P均<0.05，D、E组比较P均<0.05。

2.2各组细胞Bcl-2、Bax蛋白表达比较见表1。

表1　各组细胞Bcl-2、Bax蛋白表达及Bcl-2/Bax值比较

注：与A组比较，*P<0.05；与B组比较，#P<0.05；与C组比较，△P<0.05；与D组比较，▽P<0.05。

3　讨论

VitD3可用于低钙血症、佝偻病、骨软化症及婴儿手足搐搦症等多种疾病的治疗，其不仅能提高人体对钙、磷的吸收，还能使血浆钙、磷水平达到饱和程度[5]。近期研究发现，1,25(OH)2VitD3对乳腺癌、前列腺癌有强效抗癌活性[6]，补充高剂量VitD3可减少结直肠癌发病并延缓病情恶化[7]，提示VitD3可抑制多种肿瘤的发生、发展，对肿瘤细胞有杀伤作用[8]；并且，紫外线照射强的地区与日光照射差的地区对比，癌症发病率明显降低[9,10]。研究表明，高氧可抑制A549细胞增殖[11,12]，1,25(OH)2VitD3对肺癌细胞的增殖、血管新生具有明显抑制作用[13,14]。但是，1,25(OH)2VitD3对高氧环境肺癌细胞凋亡的影响尚不清楚。本研究结果表明，B、C、D、E组细胞凋亡指数高于A组细胞，D、E组细胞凋亡指数高于B、C组，E组高于D组，提示高氧可促进A549细胞凋亡，1,25(OH)2VitD3能够增强高氧引起的A549细胞凋亡，高剂量1,25(OH)2VitD3作用更明显。

Bax和Bcl-2与大部分细胞凋亡有密切关系，在凋亡的线粒体通路中，Bax和Bcl-2蛋白起着主要作用。Bax为促凋亡因子，Bcl-2为抑制凋亡因子，两者形成异聚体，改变线粒体膜的渗透性[15]。本研究结果显示，各组细胞Bax蛋白表达变化不大，但Bcl-2蛋白表达及Bcl-2/Bax值明显降低，高剂量1, 25(OH)2VitD3作用后变化更明显。这可能是由于大量的氧气在细胞内堆积，可产生对细胞有害的活性氧物质，并抑制Bcl-2的形成，增加了线粒体对凋亡因素的敏感性，使细胞凋亡的速度变快[16，17]。胡萍萍等[18]实验表明，VitD可促使p38磷酸化水平上调。活化的p38 MAPK信号途径作用于Bcl-2，使Bcl-2/Bax二聚体解聚，促进细胞色素 C释放，使pro-Caspase3转换为活性Caspase3，最终导致细胞凋亡。由此我们推测，1,25(OH)2VitD3也可能通过p38途径使Bcl-2蛋白失活，解除Bcl-2抑制细胞凋亡的作用，最终增强高氧诱导的A549肺癌细胞凋亡。

综上所述，1,25(OH)2VitD3可促进高氧环境中A549细胞凋亡，其作用机制可能与调节Bcl-2/Bax平衡有关，为今后研究肺癌的防治提供了新的方向。

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Effects of 1,25(OH)2VitD3on hyperoxia-induced apoptosis of lung adenocarcinoma cells

ZHANGYouchen1,JINZhengyong,XUDongyuan

(1AffiliatedHospitalofYanbianUniversity,Yanji133000,China)

Objective To observe the effects of 1, 25-dihydroxyvitamin D3[1,25(OH)2VitD3]on the apoptosis of human lung adenocarcinoma A549 cells in the high oxygen environment and to explore its mechanism. MethodsA549 cells in the logarithmic phase were randomly divided into five groups: groups A, B, C, D and F. Cells in the group A were cultured at 37 ℃, 5% CO2humidified incubator, and were not processed; cells in the group B were cultured in high-oxygen environment, and were not processed; cells in the groups C, D and E were cultured in high oxygen environment, and then were treated with 0.1, 1 and 10 μmol/L of 1,25 (OH)2VitD3for 48 h. Apoptotic cells were detected by flow cytometry, and the Bcl-2, Bax protein was detected by Western blotting.ResultsThe apoptosis indexes of groups A, B, C, D and E group were 2.45±0.91, 40.83±4.96, 42.65±4.85, 63.43±5.61 and 76.47±5.94, respectively. Significant difference was found between group A and groups B, C, D and E, allP<0.05; no significant difference was found between group B and group C,P>0.05; significant difference was found between groups D, E and groups B, C, allP<0.05; and significant difference was found between group D and group,P<0.05. Compared with group A, the Bcl-2 protein expression and Bcl-2/Bax value were decreased, but the Bax protein expression was increased in the groups B, C, D and E (allP<0.05). No significant difference was found in the Bcl-2, Bax protein expression and Bcl-2/Bax value between group B and group C, allP>0.05. Compared with group B and group C, the Bcl-2 protein expression and Bcl-2/Bax value were decreased, but the Bax protein expression was increased in the groups D and E (allP<0.05). Compared with group D, the Bcl-2 protein expression and Bcl-2/Bax value were decreased (allP<0.05), and the Bax protein expression did not change in the group E (P>0.05).Conclusion1,25(OH)2VitD3may promote the apoptosis of lung adenocarcinoma A549 cells in a high oxygen environment by regulating Bcl-2/Bax balance.

lung neoplasms; A549 cells; 1, 25-dihydroxyvitamin D3; hyperoxia; cell proliferation; apoptosis; Bcl-2 protein; Bax protein

国家自然科学基金资助项目(81160083)。

张有辰(1987-)，女，博士研究生，主要研究方向为呼吸系统疾病。E-mail: zangyoujin123@163.com

简介：许东元(1974-)，男，副教授，主要研究方向为组织修复与再生。E-mail： dyxu@ybu.edu.com

10.3969/j.issn.1002-266X.2016.22.004

R734.2

A

1002-266X(2016)22-0012-03

2016-01-12)