肿节风对猪放射性肺损伤的防护作用及机制

胡凯，刘文其，岳海英，梁菲菲，王仁生

(广西医科大学第一附属医院，南宁530021)



肿节风对猪放射性肺损伤的防护作用及机制

胡凯，刘文其，岳海英，梁菲菲，王仁生

(广西医科大学第一附属医院，南宁530021)

目的观察肿节风对放射性肺损伤小型猪模型肺纤维化及肺组织中肺泡表面活性物质相关蛋白A(SP-A)、α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)表达的影响。方法将75头小型猪随机分为正常对照组、单纯照射组及肿节风干预组各25头。肿节风干预组于照射前1周开始给予0.3 g/(kg·d)肿节风配方颗粒灌胃，直至处死日；其他两组给予等量生理盐水。动物麻醉，单纯照射组和肿节风干预组给予15 Gy/次γ射线照射右肺，正常对照组只麻醉不照射。三组分别于照射后2、4、8、12、24周随机取5头动物处死，取右肺，用HE染色及Masson染色观察肺组织病理改变，免疫组化方法检测肺组织内SP-A、α-SMA表达。结果单纯照射组照射后2周开始出现肺间质炎症改变，肺泡腔及肺间质内炎性细胞浸润，小血管及毛细血管扩张充血；照射后4周肺组织大血管及气管周边开始出现胶原纤维分布，随时间延长，胶原纤维沉积和纤维细胞增生明显增多，肺纤维化病灶明显。肿节风干预组各时间点上述炎症及纤维化程度均较单纯照射组减轻。与正常对照组比较，单纯照射组肺组织SP-A和α-SMA分别于第4周和第8周起表达下降和升高(P均<0.05)，肿节风干预组肺组织SP-A和α-SMA均从第12周起分别表达下降和上升(P均<0.05)；与单纯照射组比较时，肿节风干预组肺组织内SP-A和α-SMA分别从第4周和第12周起表达相对升高和下降(P均<0.05)。结论肿节风能显著减轻小型猪放射性肺损伤的炎症表现及纤维化程度，其可能通过减少肺泡Ⅱ型上皮细胞损伤、抑制肌成纤维细胞的转化和增殖来阻止或延缓放射性肺损伤的发生发展。

肿节风；放射性肺损伤；肺泡表面活性物质相关蛋白A；α-平滑肌肌动蛋白；猪

放射性肺损伤的关键靶细胞包括肺泡Ⅱ型上皮细胞、成纤维细胞、血管内皮细胞及巨噬细胞等[1]，其中肺泡表面活性物质相关蛋白A(SP-A)是肺泡Ⅱ型上皮细胞的分子标记物，α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)[2]是肌成纤维细胞的特异性标记物，二者常被用来监测放射性肺损伤的发生发展过程。肿节风为金粟兰科植物草珊瑚的干燥全草，具有抗菌、消炎、抗肿瘤、改善免疫功能等作用[3～5]。我们的前期研究发现，肿节风具有清除自由基、还原活性氧簇、改善氧化应激状况、减轻炎症反应等作用，对射线所致的小型猪腮腺放射性损伤具有显著的防护作用[6～8]。2012年9月～2013年9月，我们采用小型猪作为实验模型，动态观察中药肿节风配方颗粒对放射性肺损伤的肺组织病理学及SP-A、α-SMA表达的影响，探讨肿节风的放射防护作用。

1　材料与方法

1.1材料实验用雄性巴马小型猪75头，2～3月龄，体质量6.0～7.0 kg。肿节风配方颗粒由广西培力药业有限公司提供。Masson染色试剂盒及DAB显色试剂盒购自武汉博士德生物科技有限公司，SP-A及α-SMA多克隆抗体免疫组化试剂盒购自北京中杉金桥生物工程有限公司)。

1.2分组给药与照射处理将小型猪随机分为正常对照组、单纯照射组、肿节风干预组各25头。肿节风干预组于照射前1周开始给予0.3 g/(kg·d)肿节风配方颗粒灌胃，其他两组给予等量生理盐水，持续至处死日。将动物用3%戊巴比妥钠腹腔麻醉，俯卧位固定。常规X线机模拟定位，用记号笔勾画需要照射的右肺区域。将定位好的右肺暴露在照射野中，用60Co源γ射线放射治疗仪，射线从猪的背面单野垂直照射右肺，照射野面积9 cm×10 cm，源皮距80 cm，吸收剂量率3 Gy/min。单纯照射组和肿节风干预组右肺照射剂量均为15 Gy，空白组只麻醉不照射。

1.3肺组织病理检查照射后2、4、8、12、24周三组分别取5头动物处死，取右肺组织4%多聚甲醛溶液固定，脱水、浸蜡包埋，切片，每张石蜡切片包含肺组织上、中、下三个部分的截面。切片常规脱蜡至水，然后分别用苏木素染液和Masson染色试剂盒对石蜡切片进行染色，再依次完成常规梯度乙醇脱水、二甲苯透明、中性树胶封固，显微镜下观察。

1.4肺组织SP-A、α-SMA表达检测制作肺组织石蜡切片，免疫组化法检测SP-A、α-SMA表达，按试剂盒说明书操作。DAB显色，镜下见胞质呈棕黄褐色为阳性。选择切片阳性表达最明显的区域(避开大血管和大气管)，在20×10倍视野下，应用图像分析软件Image-Pro Plus6.0计算视野内阳性细胞的平均光密度(OD)值。

2　结果

2.1三组肺组织病理改变

2.1.1HE染色正常对照组肺组织结构清晰，肺泡腔、肺泡壁完整，无毛细血管充血及炎症细胞浸润，无纤维化表现。单纯照射组照射后2周开始出现肺间质炎症改变，毛细血管扩张充血，可见少量炎性细胞浸润；4周肺泡间隔水肿增宽，肺泡腔及肺间质内炎性细胞浸润增多；8周肺泡间隔明显增宽，肺泡壁明显增厚，肺泡腔内可见少量出血和纤维素样渗出；12周肺组织炎症逐渐加重，局部肺泡塌陷，肺泡间隔增宽伴融合，并可见大量炎性细胞浸润，小血管及毛细血管扩张充血，局部肺实变；24周肺组织渗出减少，病变以增生为主，肺间质内可见大量单核细胞浸润，局部可见散在分布条索状、旋涡状淡红染色的纤维素样病灶，肺部病变比较严重。肿节风干预组各时间点肺组织病理改变均较单纯照射组减轻。

2.1.2Masson染色单纯照射组照射后4周肺泡间隔内可见散在点梭状胶原纤维分布，主要分布于大血管及气管周边，未见明显的纤维化病灶形成；随时间延长，肺泡间隔内胶原纤维聚集区域逐渐增加；12周肺泡间隔内胶原纤维沉积和纤维细胞增生明显增多，局部可见明显的条索状蓝染聚集区，提示出现肺纤维化病灶；24周肺组织内可见广泛分布的层状或旋涡状胶原纤维聚集区，肺纤维化病灶非常明显。肿节风干预组与单纯照射组相比，各时间点肺组织纤维化程度均减轻。

2.2三组照射后不同时点肺组织SP-A、α-SMA表达变化见表1。

表1　三组照射后不同时点肺组织SP-A、α-SMA表达变化

注：与正常对照组同时点比较，*P<0.05；与单纯照射组同时点比较，#P<0.05。

3　讨论

中医理论认为，放射线属“热毒”之邪，其强大的穿透力不仅直接损伤肺脏血络，而且热毒袭肺，肺热内壅，脉络瘀阻，导致热伤肺络，治以补气养血、扶正活血为主[9]。中草药用于治疗放射性肺损伤已取得一定效果。奚蕾等[10]发现，黄芪能抑制中晚期胸部肿瘤患者放疗后肿瘤坏死因子α和内皮素的血浆浓度过度升高，降低放射治疗后弥散功能的恶化，有效防治放射性肺损伤。王素玲等[11]报道，接受3D-CRT放疗的Ⅲ期非小细胞肺癌患者，应用川芎嗪注射液能有效预防放射性肺炎的发生，且有放疗增敏作用，并能在一定程度上改善患者的生活质量。郑海红等[12]应用由红景天、生黄芪、党参、当归等14味中药组成扶正活血方剂给放射性肺损伤的大鼠灌胃，发现扶正活血方剂可抑制TGF-β1分泌，减轻放射性肺损伤的严重程度，阻止或延缓肺纤维化的形成。

本研究显示，肿节风干预组各时间点肺组织的炎症及纤维化程度均较单纯照射组明显减轻。与正常对照组比较，单纯照射组肺组织SP-A表达从放疗后第4周开始显著下降，α-SMA表达从放疗后第8周开始显著升高，并持续到研究终点；而肿节风干预组SP-A和α-SMA表达的变化趋势均不及单照组明显，照射后第12周开始才有统计学差异。提示肺组织经γ射线照射损伤后，以SP-A为分子标记的肺泡Ⅱ型上皮细胞数目减少，以α-SMA为标记的肌成纤维细胞数目增加。表明γ射线所产生的电磁辐射导致肺泡Ⅱ型上皮细胞凋亡，数目减少，正常肺泡结构遭到破坏，取而代之的是肌成纤维细胞的出现和纤维结缔组织的大量生成，从而发生肺组织纤维化。肿节风干预组肺组织SP-A表达明显高于单纯照射组，而α-SMA表达低于单纯照射组。说明肿节风可能通过减少由辐射所导致的肺泡Ⅱ型上皮细胞损伤、抑制肌成纤维细胞的转化增殖来阻止和延缓放射性肺损伤的发生发展，减轻其严重程度，从而发挥放射防护作用。由于肿节风成分复杂，其确切作用机制还有待进一步研究。

[1] Rubin P, Finkelstein J, Shapiro D. Moecular biology mechanisms in the radiation induction of pulmonary injury syndromes: interrelationship between the alveolar macrophage and the septal fibroblast[J]. Int J Radiat Oncol Biol Phys, 1992,24(1):93-101.

[2] Nagarajan D, Melo T, Deng Z, et al. ERK/GSK3β/Snail signaling mediates radiation-induce alveolar epithelial-to-mesenchymal transition[J]. Free Radic Biol Med, 2012,52(6):983-992.

[3] 南京中医药大学.中药大辞典(上册)[M].2版.上海:上海科学技术出版社,2006:1994-1996.

[4] 冷永涛,吕圭源,陈素红.肿节风抗肿瘤相关作用及机制研究[J].中国现代药物应用,2010,4(6):232-234.

[5] 董伟,徐国良,张启云,等.肿节风的药理作用及其在血小板减少性疾病中的应用[J].中药药理与临床,2013,29(1):176-178.

[6] 梁菲菲,张海东,王仁生,等.肿节风对辐射损伤后小型猪腮腺细胞凋亡与增殖的影响[J].实用医学杂志,2012,28(6):885-888.

[7] 张海东,王仁生,马姗姗,等.肿节风配方颗粒对小型猪腮腺放射性损伤所致活性氧簇的清除作用[J].南方医科大学学报,2011,31(1):93-95.

[8] 张婷婷,王仁生,许卓华,等.肿节风对60Co γ射线照射后小型猪腮腺细胞凋亡的抑制作用[J].中国实验方剂学杂志,2013,19(5):177-181.

[9] 赵廉栋,温馨,陈宇,等.中医药防治放射性肺纤维化的进展[J].中国中医药现代远程教育,2013,11(7):162-163.

[10] 奚蕾,夏德洪,沈伟生,等.黄芪对放射性肺损伤干预作用及对肿瘤坏死因子-α和内皮素表达影响的研究[J].中华放射医学与防护杂志,2010,30(3):327-329.

[11] 王素玲,崔克春,金传峰,等.川芎嗪防治Ⅲ期非小细胞肺癌放射性肺损伤的临床研究[J].山东中医杂志,2013,32(4):232-235.

[12] 郑海红,甘梅富,翁寿向,等.扶正活血中药治疗放射性肺损伤的实验研究[J].浙江医学,2015,37(2):104-107.

Protective effect of Sarcandra glabra on radiation-induced lung injury in pigs

HUKai,LIUWenqi,YUEHaiying,LIANGFeifei,WANGRensheng

(TheFirstAffiliatedHospitalofGuangxiMedicalUniversity,Nanning530021,China)

ObjectiveTo observe the effects of Sarcandra glabra on pulmonary fibrosis and pulmonary surfactant-associated protein (SP-A) and α-smooth muscle actin (α-SMA) expression in miniature pig models with radiation-induced lung injury. MethodsSeventy-five miniature pigs were randomly divided into the control group, radiation group and radiation plus medication group, 25 in each group. From 1 week before exposure, the miniature pigs in the radiation plus medication group were given 0.3 g/(kg·d) Sarcandra glabra by gavage until to be executed, while those in the other groups received an equal amount of normal saline. After anesthesia, the right lungs of the miniature pigs in radiation group and radiation plus medication group were exposed to γ-ray (15 Gy/time). The right lungs were taken out (five in each group) on week 2, 4, 8, 12 and 24 after the irradiation. The pathological changes were observed by HE and Masson staining, and the expression of SP-A and α-SMA was detected by immunohistochemistry in lung tissues. ResultsAt the second week after irradiation, there were inflammatory infiltration in pulmonary interstitial and alveolar cavity, and small blood vessels and capillary vessels were dilated and had congestion in the radiation group. Another 2 weeks later, collagen fibers appeared in the periphery of large blood vessels and trachea in the lung tissues. The deposition of collagen fibers and the proliferation of fibrocytes were increased with the prolonged time. The degree of inflammation and fibrosis were decreased in the radiation plus medication group during the whole experiment. Compared with the control group, the expression of SP-A and α-SMA was significantly decreased from the fourth week and increased from the eighth week in the radiation group, respectively (allP<0.05). Similar changes were observed from the twelfth week in the radiation plus medication group (allP<0.05). Compared with the radiation group, the expression of SP-A and α-SMA was relatively increased and then decreased from the fourth and twelfth week in the radiation plus medication group, respectively (allP<0.05).ConclusionsSarcandra glabra can reduce the inflammation and fibrosis of lung tissue in miniature pigs after irradiation. It plays protective effect on radiation-induced lung injury in miniature pigs by reducing the injury of alveolar type II epithelial cells, suppressing the fibroblasts transformation and delaying the radiation-induced lung injury.

Sarcandra glabra; radiation-induced lung injury; pulmonary surfactant-associated protein; α-smooth muscle actin; swine

广西科学研究与技术开发计划项目(1140003A-24)。

胡凯(1982-)，男，博士，主治医师，主要研究方向为胸腹部恶性肿瘤的放射治疗。E-mail： hukaigxmu@163.com

简介：王仁生(1963-)，男，博士，主任医师，博士研究生导师，主要研究方向为恶性肿瘤的放射治疗及并发症防治。E-mail：13807806008@163.com

10.3969/j.issn.1002-266X.2016.22.007

R818

A

1002-266X(2016)22-0021-03

2015-12-04)