治疗性低温对缺氧期心肌细胞自噬的影响及机制

杨羽菲，赵丛，杨平珍，王先宝，邓意，陈爱华

(南方医科大学珠江医院，广州510280)



·论著·

治疗性低温对缺氧期心肌细胞自噬的影响及机制

杨羽菲，赵丛，杨平珍，王先宝，邓意，陈爱华

(南方医科大学珠江医院，广州510280)

目的观察治疗性低温(TH)在缺氧期对心肌细胞自噬活性及自噬流的影响，并探讨其作用机制。方法取大鼠心肌细胞株H9c2，分为对照组、缺氧组、TH干预组、雷帕霉素干预组、雷帕霉素+TH干预组，对照组置于37 ℃培养箱中培养，不作处理；缺氧组和TH干预组构建缺氧模型后，分别置于37、32 ℃培养箱中培养；雷帕霉素干预组和雷帕霉素+TH干预组于构建模型前2 h加入雷帕霉素0.1 μmol/L，构建模型后分别置于37、32 ℃培养箱中培养。采用Western blot法检测对照组、缺氧组和TH干预组自噬相关蛋白自噬微管相关蛋白轻链3B(LC3B)、p62、Beclin-1蛋白表达，以及应用雷帕霉素前后哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)、核糖体蛋白S6(S6)的表达差异；采用腺病毒GFP-mRFP-LC3荧光瞬时转染技术检测自噬流。结果①对照组、缺氧组和TH干预组LC3B、p62、Beclin-1蛋白表达：缺氧组和TH干预组LC3B、Beclin-1高于对照组(P均<0.05)，缺氧组p62降低(P<0.05)。TH干预组LC3B明显低于缺氧组，p62增高(P均<0.05)。缺氧组与TH干预组Beclin-1无统计学差异。②雷帕霉素处理后自噬蛋白LC3B、p62及mTOR通路相关蛋白p-mTOR、p-S6表达：TH干预组与缺氧组比较LC3B降低，而p62、p-mTOR和p-S6均升高(P均<0.05)；雷帕霉素干预组与缺氧组比较LC3B升高，p62降低(P均<0.05)，而p-mTOR和p-S6差异无统计学意义；雷帕霉素+TH干预组与TH干预组比较LC3B升高，p62、p-mTOR和p-S6均降低，结果均有统计学差异(P均<0.05)；雷帕霉素+TH干预组与雷帕霉素干预组比较LC3B降低，p62升高(P均<0.05)，而p-mTOR和p-S6差异无统计学意义。③双荧光自噬流：缺氧组和TH干预组的黄点和红点数多于对照组(P均<0.05)，TH干预组的黄点与红点数少于缺氧组(P均<0.05)。结论 TH能够抑制缺氧期心肌细胞自噬，其机制可能与促进mTOR信号通路相关蛋白表达有关。

治疗性低温；心肌细胞；缺氧；自噬；雷帕霉素

治疗性低温(TH)能够减少活性氧族(ROS)产生，改善细胞内离子水平，保持细胞内pH平衡[1～3]，影响细胞能量代谢，减轻细胞损害，对缺氧缺血的心肌细胞有一定的保护作用，是临床治疗缺血性疾病的有效方法。自噬是指细胞质内大分子物质被包裹并传递至溶酶体进行降解，维持细胞内的物质与能量平衡。研究认为，自噬是心肌细胞存活与否的关键调节因素之一。雷帕霉素靶蛋白(mTOR)是在哺乳动物细胞中负向调控自噬的关键蛋白，其活化对自噬具有抑制作用[4]。mTOR通路是缺血期调控自噬的两条经典通路之一。磷酸化的mTOR(p-mTOR)是mTOR通路活化的标志。核糖体蛋白6(S6)是mTOR下游的一个效应蛋白，磷酸化S6(p-S6)被认为是mTOR激活程度的重要标记蛋白。2014年1月～2016年1月，我们观察了TH在大鼠心肌细胞缺氧期对H9c2细胞自噬活性相关蛋白[自噬微管相关蛋白轻链3B(LC3B)、p62及Beclin-1]表达的影响，并采用雷帕霉素抑制mTOR信号通路，观察心肌细胞自噬活性相关蛋白和mTOR通路相关蛋白p-mTOR、p-S6的变化，探讨TH治疗心肌细胞缺氧损伤的作用机制。

1　材料与方法

1.1材料大鼠心肌细胞株H9c2购自美国ATCC公司。自噬蛋白LC3B、p62、Beclin-1相关一抗、mTOR信号通路相关一抗购于美国CST公司，相关二抗购于武汉博士德公司。雷帕霉素购于美国Sigma-Aldrich公司。

1.2心肌细胞自噬活性检测采用Western blot法。将大鼠心肌细胞置于含10%胎牛血清的高糖DMEM培养基中，5% CO2、37 ℃培养箱中培养。细胞融合至70%～90%后用于实验。将细胞分为对照组、缺氧组、TH干预组,对照组置于37 ℃培养箱中培养，不作处理；其余两组向细胞中加入PBS，移入细胞缺氧盒，注入含5% CO2和95% N2的混合气体构建缺氧模型，分别置于37、32 ℃培养箱中培养。向细胞悬液中加入蛋白裂解液，收集上清，加入15% SDS-PAGE分离蛋白，将凝胶蛋白转至PVDF膜上，室温封闭2 h，加入相应的一抗、二抗，4 ℃过夜孵育。以ECL试剂为底物，X线曝光，显色、定影。采用Quantity One 4.6软件对发光条带的灰度值进行分析，以β-actin作为内参，计算LC3B、p62、Beclin-1蛋白的相对表达量。实验重复3次。

1.3雷帕霉素对心肌细胞自噬及mTOR通路蛋白的影响观察将细胞分为缺氧组、TH干预组、雷帕霉素干预组、雷帕霉素+TH干预组。缺氧组、TH干预组处理同1.2，雷帕霉素干预组与雷帕霉素+TH干预组于缺氧造模前2 h加入雷帕霉素0.1 μmol/L，造模后分别置37、32 ℃培养箱中培养。采用Western blot法检测LC3B、p62及p-mTOR和p-S6蛋白表达，加入相应抗体，计算其相对表达量，操作及计算方法参照1.2。

1.4心肌细胞自噬流检测采用GFP-mRFP-LC3荧光瞬时转染技术。用腺病毒GFP-mRFP-LC3瞬时转染心肌细胞，培养36 h后分为对照组、缺氧组、TH干预组，分别处理3 h。由于GFP 绿色荧光和mRFP 红色荧光在自噬体同时存在，在红、绿荧光合成图像中呈黄色；但在自噬溶酶体酸性环境中GFP 绿色荧光降解，只剩下红色荧光。以合成图像中的黄色亮点(自噬体)和红色亮点(自噬溶酶体)数量反映细胞内自噬囊泡的数量。分组处理细胞后在400倍荧光显微镜下观察，随机采集300 个细胞内的红、绿色LC3 荧光图，计数其合成图像中平均每个细胞含有的黄色亮点和红色亮点的个数。实验重复3次。

2　结果

2.1各组LC3B、p62、Beclin-1蛋白相对表达量比较缺氧组和TH干预组LC3B、Beclin-1高于对照组(P均<0.05)，缺氧组p62降低(P<0.05)。TH干预组LC3B低于缺氧组，p62增高(P均<0.05)。缺氧组与TH干预组Beclin-1无统计学差异。见表1。

表1　各组LC3B、p62和Beclin-1蛋白相对表达量比较±s)

注：与对照组比较，*P<0.05；与缺氧组比较，#P<0.05。

2.2雷帕霉素处理后各组LC3B、p62、p-mTOR、p-S6蛋白相对表达量比较TH干预组与缺氧组比较LC3B降低，而p62、p-mTOR和p-S6均升高(P均<0.05)；雷帕霉素干预组与缺氧组比较LC3B升高，p62降低(P均<0.05)，而p-mTOR和p-S6差异无统计学意义；雷帕霉素+TH干预组与TH干预组比较LC3B升高，p62、p-mTOR和p-S6均降低，结果均有统计学差异(P均<0.05)；雷帕霉素+TH干预组与雷帕霉素干预组比较LC3B降低，p62升高(P均<0.05)，而p-mTOR和p-S6差异无统计学意义。见表2。

2.3各组细胞双荧光自噬流检测结果缺氧组和TH干预组的黄点和红点多于对照组(P均<0.05)，TH干预组的黄点与红点少于缺氧组(P均<0.05)。见表3。

3　讨论

细胞自噬是指在细胞内通过形成双层脂质膜包裹细胞内细胞器或细胞内物质(自噬小体)，随之与溶酶体结合并降解的过程[5]。LC3B是自噬体膜上的标记蛋白,细胞内LC3B蛋白的变化通常与自噬活性联系密切，被广泛用于自噬活性的研究[6]。另一个被广泛应用的自噬标记蛋白p62，其降解程度能有效反映自噬活性[7]。Beclin-1是细胞自噬的一个关键调控因子，是自噬体形成不可或缺的条件[8]。研究显示，TH是一种多重机制的治疗方式，它对细胞的保护机制多与应用TH的开始时间有关。缺血期应用TH要优于再灌注期，不仅可以减少缺血期产生的病理产物ROS等，还可能影响再灌注期间炎症信号通路等[9]。尽早应用TH可使机体获益更多。TH能有效抑制缺血期H9c2细胞的坏死与凋亡[10]，缺血前或再灌注治疗前应用TH均能减少H9c2细胞凋亡。然而TH调控自噬及其相关机制少见报道。

表2　各组LC3B、p62、p-mTOR、p-S6蛋白相对表达量比较

注：与缺氧组比较，*P<0.05；与TH干预组比较，#P<0.05；与雷帕霉素干预组比较，△P<0.05。

表3　各组荧光点数比较(个，±s)

注：与对照组比较，*P<0.05；与缺氧组比较，#P<0.05。

近期文献报道，在大鼠心肌顿抑模型中，TH能有效恢复神经功能，并通过抑制自噬改善海马旁回脑细胞活性[11]。另外，TH可以通过抑制凋亡、降低过度自噬修复缺血损伤的脑脊髓神经功能[12,13]。在缺血再灌注损伤的心肌细胞中，TH改善细胞活性并下调自噬水平[14]。本研究表明，TH可降低缺氧期间H9c2心肌细胞自噬水平(降低LC3B、升高p62)，在缺氧损伤环境下表现出抑制细胞自噬活性。Beclin-1在自噬诱导的起始阶段起重要作用[15]，但缺氧组与TH干预组相比，Beclin-1表达并无统计学差异。表明TH对自噬的影响并不依赖Beclin-1的表达，与以往报道[14]相符。

为了探讨TH对自噬活性的调节机制，我们进一步对mTOR信号通路进行研究。mTOR信号通路的激活对细胞自噬活性具有负性调节作用[16]。作为mTOR信号通路的关键成员，mTOR和S6蛋白磷酸化与自噬的调控密切相关[17]。p-mTOR及p-S6表达可反映mTOR通路激活程度[18]，表达升高提示mTOR信号通路高度激活，并会对自噬活性造成显著抑制[18]。而雷帕霉素作为自噬活性的经典激活剂，可抑制mTOR信号通路，从而激活自噬。本研究显示，TH能通过促进mTOR和S6蛋白磷酸化来激活mTOR通路(使p-mTOR、p-S6表达升高)，并抑制缺氧期间H9c2的自噬水平(使LC3B降低、p62升高)。然而当雷帕霉素作用于TH干预下的缺氧期H9c2细胞时，TH对自噬的抑制作用完全消失，取而代之的是自噬活性的强烈激活，并且雷帕霉素也逆转了TH对p-mTOR和p-S6的促表达作用。简而言之，雷帕霉素的介入抑制了mTOR信号通路(p-mTOR、p-S6表达降低)，同时也强烈激活了原本受到TH抑制的自噬活性，说明TH或可通过激活mTOR信号通路抑制自噬活性。

自噬流是指自噬的完整过程，自噬小体的双层膜结构包裹部分胞质和细胞内需降解的细胞器、蛋白质等形成自噬体，最后与溶酶体融合形成自噬溶酶体，降解其所包裹的内容物，以实现细胞稳态和细胞器的更新[19]。因此，较之以LC3B和p62蛋白表达来反映细胞自噬活性，自噬流的检测更加直观，可以更方便地对自噬形成过程的各个阶段进行分析解读。本研究显示，与对照组相比，缺氧组与TH处理组的黄色荧光点数、红色荧光点数增多，提示缺氧促进了H9c2心肌细胞自噬小体和自噬溶酶体的升高，而TH则部分减少了缺氧后H9c2心肌细胞自噬小体和自噬溶酶体，与缺氧组相比，TH处理组的自噬体、自噬溶酶体减少。说明TH能够通过抑制缺氧期H9c2心肌细胞自噬小体的形成，从而抑制自噬流水平。

综上所述，TH可通过mTOR相关信号通路对细胞自噬流进行调控，抑制缺氧期H9c2心肌细胞的自噬流。此研究揭示了TH在心血管系统中又一新的机制，为缺血性心脏病的治疗提供了理论依据。

[1] Aoki M, Nomura F, Stromski ME, et al. Effects of ph on brain energetics after hypothermic circulatory arrest[J]. Ann Thorac Surg, 1993,55(5):1093-1103.

[2] Polderman KH. Mechanisms of action, physiological effects, and complications of hypothermia[J]. Crit Care Med, 2009,37(7 Suppl):S186-202.

[3] Shao ZH, Sharp WW, Wojcik KR, et al. Therapeutic hypothermia cardioprotection via akt- and nitric oxide-mediated attenuation of mitochondrial oxidants[J]. Am J Physiol Heart Circ Physiol, 2010,298(6):2164-2173.

[4] Pattingre S, Espert L, Biard-Piechaczyk M, et al. Regulation of macroautophagy by mtor and beclin 1 complexes[J]. Biochimie, 2008,90(2):313-323.

[5] Pyo JO, Nah J, Jung YK. Molecules and their functions in autophagy[J]. Exp Mol Med, 2012,44(2):73-80.

[6] Kabeya Y, Mizushima N, Ueno T, et al. Lc3, a mammalian homologue of yeast apg8p, is localized in autophagosome membranes after processing[J]. EMBO J, 2000,19(21):5720-5728.

[7] Pankiv S, Clausen TH, Lamark T, et al. P62/sqstm1 binds directly to atg8/lc3 to facilitate degradation of ubiquitinated protein aggregates by autophagy[J]. J Biol Chem, 2007,282(33):24131-24145.

[8] Funderburk SF, Wang QJ, Yue Z. The beclin 1-vps34 complex--at the crossroads of autophagy and beyond[J]. Trends Cell Biol, 2010,20(6):355-362.

[9] Lampe JW, Becker LB. State of the art in therapeutic hypothermia[J]. Annu Rev Med, 2011,62(1):79-93.

[10] Lin CH, Wu WS, Lin MT, et al. Attenuating ischemia-induced h9c2 myoblasts apoptosis by therapeutic hypothermia[J]. Am J Med Sci, 2010,339(3):258-265.

[11] Lu J, Qian HY, Liu LJ, et al. Mild hypothermia alleviates excessive autophagy and mitophagy in a rat model of asphyxial cardiac arrest[J]. Neurol Sci, 2014,35(11):1691-1699.

[12] Seo JY, Kim YH, Kim JW, et al. Effects of therapeutic hypothermia on apoptosis and autophagy following spinal cord injury in rats[J]. Spine, 2015,40(12):883.

[13] Choi KE, Hall CL, Sun JM, et al. A novel stroke therapy of pharmacologically induced hypothermia after focal cerebral ischemia in mice[J]. FASEB J, 2012,26(7):2799-2810.

[14] Cheng BC, Huang HS, Chao CM, et al. Hypothermia may attenuate ischemia/reperfusion-induced cardiomyocyte death by reducing autophagy[J]. Int J Cardiol, 2013,168(3):2064-2069.

[15] Kihara A, Noda T, Ishihara N, et al. Two distinct vps34 phosphatidylinositol 3-kinase complexes function in autophagy and carboxypeptidase y sorting in saccharomyces cerevisiae[J]. J Cell Biol, 2001,152(3):519-530.

[16] Dibble CC, Manning BD. Signal integration by mtorc1 coordinates nutrient input with biosynthetic output[J]. Nat Cell Biol, 2013,15(6):555-564.

[17] Tan VP, Miyamoto S. Nutrient-sensing mTORC: Integration of metabolic and autophagic signals[J]. J Mol Cell Cardiol, 2016.PMID:26773603

[18] Jung CH, Ro SH, Cao J, et al. Mtor regulation of autophagy[J]. FEBS Lett, 2010,584(7):1287-1295.

[19] Gatica D, Chiong M, Lavandero S, et al. Molecular mechanisms of autophagy in the cardiovascular system[J]. Circ Res, 2015,116(3):456-467.

Effect and mechanism of therapeutic hypothermia on autophagy in hypoxia cardiomyocytes

YANGYufei,ZHAOCong,YANGPingzhen,WANGXianbao,DENGYi,CHENAihua

(ZhujiangHospital,SouthernMedicalUniversity,Guangzhou510280,China)

ObjectiveTo investigate the effects of therapeutic hypothermia (TH) on autophagy and autophagic flux of cardiomyocytes in ischemia and to explore the underlying mechanism. MethodsH9c2 rat cardiomyocytes were divided into the control group, hypoxia group, hypoxia + TH group, rapamycin + hypoxia group and rapamycin + hypoxia+ TH group. Cells in the control group were normally cultured at 37 ℃ and received no further treatments. Cells with or without TH treatment in the other four groups were subjected to hypoxia in a hypoxic chamber at 32 ℃ or 37 ℃ respectively. Then, 0.1 μmol/L rapamycin was added 2 h before cells were subjected to hypoxia at 32 ℃ or 37 ℃. Western blotting was performed to detect protein expression of LC3B, p62, Beclin-1, phospho-mTOR (p-mTOR) and phospho-S6 (p-S6). The autophagic flux was detected under adenovirus GFP-mRFP-LC3 confocal laser scanning microscopy.Results①The protein expression of LC3B, p62 and Beclin-1 in the control group, hypoxia group and hypoxia + TH group: compared with the control group, LC3B and Beclin-1 expression was significantly increased in the hypoxia group and hypoxia + TH group (allP<0.05), while p62 expression was significantly decreased in the hypoxia group (P<0.05). Hypoxia + TH group exhibited lower LC3B expression as well as higher p62 expression as compared with that of the hypoxia group (P<0.05). There was no significant difference in Beclin-1 expression between the hypoxia group and hypoxia+TH group. ② The expression of autophagy-related proteins LC3B, p62 and mTOR pathway-related proteins p-mTOR and p-S6 after rapamycin treatment: compared with the hypoxia group, hypoxia + TH group showed decreased expression of LC3B and increased expression of p62, p-mTOR and p-S6 (allP<0.05). Compared with the hypoxia group, rapamycin+hypoxia group showed higher expression of LC3B and lower expression of p62 (allP<0.05), while there were no significant differences in p-mTOR and p-S6. Rapymycin + hypoxia+TH group showed increased LC3B and decreased p62, p-mTOR and p-S6 expression as compared with that of the hypoxia+TH group, and significant difference was found between them (allP<0.05). The rapamycin + hypoxia+TH group showed lower LC3B and higher p62 expression (allP<0.05), but there were no significant differences in p-mTOR and p-S6 expression between rapamycin + hypoxia+TH group and rapamycin +hypoxia group. ③ Detection of autophagic flux: compared with the control group, the green and red puncta were significantly higher in the hypoxia group and hypoxia + TH group (allP<0.05). Hypoxia + TH group showed less green and red puncta than those of the hypoxia group (allP<0.05). ConclusionTH inhibits the autophagic flux of hypoxic cardiomyocytes and the mechanism may be related to the activation of mTOR pathway-related proteins.

therapeutic hypothermia; cardiomyocytes; hypoxia; autophagy; rapamycin

国家自然科学基金资助项目(81400190，81270218)；广东省自然科学基金资助项目(2015A030310478)；广东省科技计划项目(2014A020212191)。

杨羽菲(1989-)，女，在读硕士研究生，主要研究方向为自噬在心肌缺血损伤中的影响及机制。E-mail: lvyyang0608@163.com

简介：陈爱华(1956-)，男，博士，教授，主要研究方向为自噬在心肌缺血和缺血再灌注损伤中的影响及机制。E-mail: zj_chenaihua@126.com

10.3969/j.issn.1002-266X.2016.22.001

R541.2

A

1002-266X(2016)22-0001-04

2016-02-25)