多药耐药基因多态性对钙拮抗剂治疗中国汉族终末期肾脏病患者降压疗效的影响*

周君，陈菊，羊永梅，潘妙霞

（海南省海口市人民医院 肾内科，海南 海口 570208）



论著

多药耐药基因多态性对钙拮抗剂治疗中国汉族终末期肾脏病患者降压疗效的影响*

周君，陈菊，羊永梅，潘妙霞

（海南省海口市人民医院 肾内科，海南 海口 570208）

摘要：目的探讨终末期肾脏病（ESR D）患者多药耐药基因（MDR1）多态性与二氢吡啶类钙拮抗剂（CCB）降压疗效的相关性。方法选取215例ESR D患者，采用聚合酶链式反应-直接测序法检测MDR1基因多态性，分析MDR1基因型与CCB降压疗效的相关性。结果MDR1基因频率符合Hardy-Weinberg平衡分布；血压达标组中CT突变杂合子型与CC野生型、TT纯合子比较，Scr增加（P<0.05）；且MDR1C3435T基因型与CCB的降压疗效无关（P>0.05）。结论MDR1C3435T多态性与CCB的降压疗效无关，同时发现血压达标组中MDR1C3435T基因多态性与Scr水平相关，是否提示CT型患者更容易进展至ESR D，尚需要在更大样本中进一步检验。

关键词：多药耐药基因；终末期肾脏病；钙拮抗剂

终末期肾脏病（endstage renal disease，ESRD）患者每年以>10%的速度增长。AGARWAL等[1]对美国2 535例维持性血液透析患者进行调查发现，86%的患者存在高血压。DAVENPORT等[2]对2630例血液透析患者调查显示，血液透析患者透析前血压< 140/90 mmHg者只有36%，透析后血压<130/80mmHg者为42%，透析前与透析后血压均达标的患者仅为26%。大多数ESRD患者需要应用≥2种降压药物以达到血压控制的目标值。长效钙拮抗剂（calcium channel blockers，CCB）由于降压疗效明显，拥有最多的联合治疗方案，透析期间无需调整剂量，是ESRD患者的优选降压药物之一。

多药耐药基因（multidrug resistance，MDR1）与代谢酶cyp3a共同组成影响药物代谢动力学的两大主要因素。MDR1编码的基因产物即为P糖蛋白（P-glyceprotein，P-gp），是一种腺嘌呤核苷三磷酸（adenosine triphosphate，ATP）依赖性的外向型转运泵，由1 280个氨基酸组成，该蛋白在大肠及小肠的黏膜、血脑屏障、肝细胞、肾近端小管等处均有分布[3]。其负责将进入细胞内的作用底物（包括化学物质和药物等）主动泵出细胞外，对药物的体内代谢过程起到重要作用。研究证实，MDR1的基因多态性影响P-gp的表达及功能。MDR1存在50多种单核苷酸多态性，当前的焦点集中于其第26号外显子（C3435T）。这是目前为止发现的唯一一个静寂多态性，可能影响P-gp在不同组织和不同种族之间的表达[4]。

MDR1多态性与ESRD的关系密切，有学者研究中国ESRD患者MDR1C3435T基因多态性与ESRD的关系，发现携带3435TT和3435CC基因者更容易进展至ESRD，P-gp低表达可能促进ESRD的进展并影响其严重性[5]。近期还发现，MDR1为新的高血压候选基因，可能与P-gp协调RAS系统相关[6]。

氨氯地平、硝苯地平、非洛地平等CCB均由P-gp转到细胞外，其可限制CCB在细胞内过度聚集并促进其从尿液中排出[7]。目前，未见MDR1基因多态性影响ESRD患者使用CCB降压疗效的报道，因此本研究探讨MDR1基因多态性是否与中国汉族ESRD患者高血压相关，以及是否影响CCB降压疗效。

1　资料与方法

1.1一般资料

选取2011年1月-2014年5月因慢性肾脏病5期在海口市人民医院进行规律腹膜透析（peritoneal dialysis，PD）和血液透析（hemodialysis，HD）的患者。HD组，3次/周维持性血透，每次透析4.0～4.5h。PD组每日行非卧床维持性腹膜透析，透析6～10 L/d。纳入条件：①稳定的维持性透析患者（透析龄≥4个月），年龄≥18岁，性别不限。②患者在坐位静息5min后测量收缩压（systolic blood pressure，SBP）/舒张压（diastolic blood pressure，DBP），根据2014年美国成人高血压治疗指南高血压诊断标准[8]。在未使用降压药物的情况下，SBP<140 mmHg和/或DBP<90mmHg，为血压正常组；SBP≥140mmHg和/或DBP≥90 mmHg为高血压组，其中SBP<150 mmHg 和/或DBP<90mmHg为血压达标组；SBP≥150mmHg 和/或DBP≥90 mmHg为血压未控制组。③高血压患者以CCB作为首选降压药，如服药4周血压控制不佳，可依次加用血管转换酶抑制剂、血管紧张素受体拮抗剂及β受体阻滞剂，所使用剂量相同。根据使用的CCB，将患者分成3组，再根据CCB降压疗效进行亚组分析：如血压达标为治疗有效组，如高血压未控制为治疗无效组。④治疗反应。HD患者透析当日及PD患者门诊每月随诊1～3次，取平均值，同时计算SBP下降幅度（ΔSBP）和DBP下降幅度（ΔDBP）；根据血压降幅将疗效分层：低效组ΔSBP< 10 mmHg或ΔDBP<5 mmHg；中效组ΔSBP 10～20 mmHg或ΔDBP 5～10 mmHg；高效组ΔSBP≥20mmHg或ΔDBP≥10mmHg。⑤透析当日透析前空腹抽血检测血红蛋白（Haemoglobin，Hb）、血肌酐（serum creatinine，Scr）和全段甲状旁腺激素（intact parathyroid hormone，iPTH）水平，所有PD患者在开始PD后1～3个月行腹膜平衡试验及透析充分性检测。⑥HD患者在线评估Kt/V≥1.2及PD患者Kt/V≥1.7，且干体重达标。⑦残余肾功能的评估。所有患者留取24h尿量、超滤量等。排除标准：①因急性肾衰竭行透析治疗的患者；②依从性差，未在本科规律随访；③存在恶性肿瘤、智力障碍者；④HD患者在线评估Kt/V<1.2及PD患者Kt/V<1.7。观察期间促红细胞生成素采用100 IU/（kg·周）皮下注射。所有研究对象自愿参加实验，并签署知情同意书，本研究通过本院伦理委员会同意。

1.2研究方法

1.2.1实验室检查包括Hb、Scr、iPTH水平，每3个月复查1次，取平均值；PD患者入组时留取24 h尿量和透出液检测尿素氮、肌酐水平进行Kt/V检测。

1.2.2基因多态性检测抽取静脉血3 ml乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA）抗凝，低渗溶血法分离白细胞，酚氯仿抽提法提取DNA。应用聚合酶链式反应-直接测序法检测MDR1基因。MDR1C3435T位点正向引物：5'-TGTTTTCAGCTGCTTGATGG-3'，反向引物：5'-AAGGCAT GTATGTT-GGCCTC-3'。15μl PCR反应体系包括：10×PCR buffer 1.5μl，dNTPs（2.5mmol）0.3μl，每条引物（50mmol/L）0.1μl，耐热性DNA聚合酶（5u/μl）0.2μl，基因组DNA 2μl，聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）10.8μl。PCR反应条件：94℃预变性5 min，94℃变性45 s，52～60℃退火45 s，72℃延伸45 s，共37个循环，72℃继续延伸7 min。PCR产物限制性酶切分析：5 uBsp1431 37℃进行酶切8 h，酶切产物使用2.5%的琼脂糖凝胶进行电泳分析，紫外灯下观察结果，凝胶成像系统照片。

1.3统计学方法

采用SPSS 16.0统计软件进行数据分析，计量资料以均数±标准差（±s）表示，临床资料组间比较用χ2检验或单因素方差分析（One-way，ANOVA）；计数资料以率表示，用Hardy-Weinberg平衡检验和χ2检验，不同基因型在人数、年龄、SBP、ΔSBP、DBP、ΔDBP、Hb、Scr和iPTH等各参数比较用单因素方差分析，进行性别因素的校正，最后进行多元线性回归分析，P<0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1一般情况

共220例ESRD患者入组。其中，HD组70例，PD组150例，男性134例，女性86例；平均年龄（53.31±14.70）岁。1例多发性骨髓瘤，1例肾癌，3例失访而排除，最终215例患者入组。其中慢性肾炎106例，糖尿病肾病87例，梗阻性肾病7例，系统性红斑狼疮5例，多囊肾病5例，其他5例。HD组平均Kt/V=（1.43±0.18），PD组Kt/V=（1.81±0.12）；血压正常组31例，高血压组184例。其中，血压达标组127例，血压未控制组57例，平均ΔSBP=（18.37± 4.35）mmHg，平均ΔDBP=（9.35±1.80）mmHg。各组的临床特征除高血压组SBP增高（P=0.000），其余指标比较差异无统计学意义。见表1。

表1　ESRD患者的临床特征和实验室检查

2.2MDR1C3435T基因频率Hardy-Weinberg平衡分布和遗传模型分析

MDR1C3435T基因多态性基因频率符合Hardy-Weinberg平衡分布（CC=29.8%，CT=50.7%，TT=19.5%，P=0.965）（见表2），提示来自同一孟德尔群体。采用显性和隐性两种遗传模型分析发现，MDR1 C3435T基因在血压达标组和血压未控制组之间的分布比较，差异无统计学意义（P>0.05）（见表3），说明MDR1C3435T基因型与ESRD患者高血压无关。

2.3MDR1C3435T不同基因型各临床指标的比较

血压达标组和血压未控制组MDR1C3435T不同基因型在年龄、性别、Hb、iPTH、SBP和DBP等临床指标方面比较，差异无统计学意义（P>0.05），血压达标组中CT突变杂合子型与CC野生型、TT纯合子比较，Scr增加（P<0.05）。见表4。

2.4MDR1基因多态性与CCB降压疗效的相关性

根据所使用CCB将研究人群分为3组：第1组

表2215　例ESRD患者MDR1C3435T基因Hardy-Weinberg平衡试验　例（%）

表3　显性与隐性遗传模型比较　例

表4　血压达标组和血压未控制组MDR1C3435T基因型的临床特征

为硝苯地平控释片组，占总人数的47%；第2组为苯磺酸氨氯地平组，占20.9%；第3组为非洛地平缓释片组，占17.6%。亚组分析中，治疗有效组144例，治疗无效组40例。由于基因型是三分类变量，设置哑变量，生成2个新的哑变量dum1和dum2来表示MDR1的基因型，对应于TT、CT和CC 3种基因型，dum1和dum2的变量赋值分别是0和0、0和1、1 和1，以ΔSBP和ΔDBP为因变量，年龄、Hb、Scr、iPTH、CCB、dum1和dum2为协变量，进行多元线性回归，结果显示，差异无统计学意义（P>0.05），提示MDR1基因多态性与CCB的降压疗效无关。见表5。

表5　血压降幅与各临床指标的多元回归分析

3　讨论

2009年有两篇研究对透析患者高血压治疗进行荟萃分析，结果显示，控制高血压可以降低透析患者的死亡风险，降压治疗明显减少透析患者心血管事件、全因死亡率及心血管死亡率[9-10]。KREVOLIN 等[11]发现，约50%ESRD患者血压控制未达标，提示ESRD患者血压的控制达标率低。降压疗效的个体化差异可能与个体内在属性差异有关。遗传药理学的研究结果显示，20%～95%药物反应和初治的个体差异是由遗传因素引起[12]。本研究中MDR1C3435T的变异频率为50.6%，与其他报道数据（41%～66%）一致[13]。本研究初步分析显示，MDR1C3435T基因多态性对ESRD患者血肌酐水平存在影响，而对以CCB为主要降压药物的降压疗效影响可能不大。

2013年LIU等[14]研究中国人MDR1基因多态性与慢性肾脏病及高血压的关系，入选1987例CKD患者，结果发现年龄>60岁的老年人中，TT型纯合子与CKD患病风险相关（P=0.040），因此认为MDR1 C3435T基因多态性可预测CKD，尤其是老年人。而本研究发现，CT基因型与TT、CC型比较，血肌酐增加。其是否提示CT型患者更容易进展至ESRD，还需要进一步研究。

MDR1基因多态性不但与慢性肾脏病关系密切，并且近期研究显示，MDR1可作为新的高血压候选基因[15]。MDR1基因突变影响P-gp表达，而P-gp具有协调RAS系统的作用。大鼠动物实验显示，P-gp可将醛固酮转运出心脏，MDR1-/-鼠通过P-gp介导对血管紧张素Ⅱ反应出现高血压[16]。人类的研究显示，MDR1 3435C>T变异影响血管紧张素Ⅱ刺激血醛固酮的合成和尿钠排泄水平，3435C>T突变影响P-gp稳定性和底物mRNA的表达，其中CC表达水平最高，TT表达水平最低[17]。因为醛固酮对血压调节起重要作用，所以推测MDR1基因的突变可能影响血压。本研究发现，MDR1基因多态性与ESRD患者SBP、DBP无关（P>0.05）；可能与MDR1 C3435T为沉默突变，是同义突变，即C被T所替代后，氨基酸的组成没有发生改变相关。

本研究还发现，MDR1C3435T基因对ESRD高血压患者以CCB为主要降压药物的降压疗效无明显影响，WEN等[18]亦发现，MDR1C3435T基因多态性对氨氯地平的药代动力学也无明显影响。这可能是MDR1C3435T为同义突变，氨基酸的序列没有改变，由于P-gp不是CCB跨膜转运的主要影响因素，因此P-gp水平的改变对CCB的跨膜转运影响较小相关。

本研究还存在以下不足：①每种CCB在体内代谢不是只有一种途径，影响CCB发挥临床作用的也并不仅仅是P-gp，因此为结果的可靠性带来不可避免的混杂因素，从而对本研究结果产生影响；②本研究中没有测定CCB的血药浓度，为进一步分析和解释结果带来不便；③样本例数相对较少，且缺乏安慰剂对照组；④本研究为一项回顾性非随机研究，样本量有限，并且多数患者存在合并用药，可能影响结果。

本研究发现，中国汉族ESRD患者MDR1C3435T等位基因分布频率在各组间比较，差异无统计学意义（P>0.05），而血压达标组中CT基因型患者与CC型、TT型比较，血肌酐水平显著增加，提示中国汉族ESRD患者MDR1C3435T多态位点与血肌酐水平有关，是否提示CT型患者更容易进展至ESRD，还需要进一步研究。同时还发现，MDR1C3435T基因多态性与CCB降压疗效无关。说明个体对降压药物反应的多样化是由多种因素作用的结果，单一因素的分析可能并不能解释疾病发生的原因，高血压的发生不仅仅由某一位点的单核苷酸多态性引起。另外，人口学、生理学、病理学等环境因素也可能影响C CB的药代动力学和药物效应。

参考文献：

[1]AGARWAL R,NISSENSON A R,BATLLE D,et al.Prevalence, treatment,and control of hypertension in chronic hemodialysis patients in the United States[J].Am J Med,2003,115(4):291-297.

[2]DAVENPORT A,COX C,THURAISINGAM R.Achieving blood pressure targets during dialysis improves control but increase intradialytic hypotension[J].Kidney Int,2008,73(6):759-764.

[3]ZHAO J J,WANG D,YAO H,et al.CTLA-4 and MDR1 polymorphisms increase the risk for ulcerative colitis:A meta-analysis[J]. World J Gastroenterol,2015,21(34):10025-10040.

[4]AYDOS S E,KARADAG A,OZKAN T,et al.Association of MDR1 C3435Tand C1236Tsingle nucleotide polymorphisms with male factor infertility[J].Gene Mol Res,2015,14(2):6330-6339.

[5]ZHANG W X,CHEN B,ZHANG W,et al.Effect of MDR1 gene polymorphism on progression of end-stage renal disease[J].Acta Pharmacol Sin,2007,28(4):579-583.

[6]ZUO X C,ZHANG W L,YUAN H,et al.ABCB1 polymorphism and gender affect the pharmacokinetics of amlodipine in Chinese patiets with essential hypertension:a population analysis[J].Drug Metab Pharmacokinet,2014,29(4):305-311.

[7]GUO C,PEI QI,TAN H,et al.Effects of genetic factors on the pharmacokinetics and pharmacodynamics of amlodipine in primary hypertensive patients[J].Biomed Rep,2015,3(2):195-200.

[8]JAMES P A,OPARIL S,CARTER B L,et al.2014 evidencebased guideline for the management of high blood pressure in adults:report from the panel members appointed to the eighth joint national committee(JNC 8)[J].JAMA,2014,311(5):507-520.

[9]HEERSPINK H J,NINOMIYA T,ZOUNGAS S,et al.Effect of lowering blood pressure on cardiovascular events and mortality in patients on dialysis:a systematic review and meta-analysis of randomized controlled trials[J].Lancet,2009,373(9668):1009-1015.

[10]AGARWAL R,SINHA A D.Cardiovascular protection with antihypertensive drugs in dialysis patients:systematic review and meta-analysis[J].Hypertension,2009,53(5):860-866.

[11]KREVOLIN L,LIAGAN J.Blood pressure control improving medication compliance among ESRD patients[J].Nephrol News Issues,2015,29(9):33-36.

[12]钟建勋,辛华雯.免疫抑制药的药物基因组学研究进展[J].中国药师,2014,17(5):861-865.

[13]WANG D,JOHNSON A D,PAPP A C,et al.Multidrug resistance polypeptide 1(MDR1,ABCB1)variant 3435C>T affects mRNA stability[J].Pharmacogenet Genomics,2005,15:693-704.

[14]LIU M,LI Y,LORENA C,et al.A functional common polymorphism ot the ABCB1 gene is associatiatied with chronic kidney disease and hypertension in Chinese[J].American J Hypertension,2013,5:1-9.

[15]PARKER R B,YATES C R,LAIZURE S C,et al.P-glycoprotein modulates aldoserone plasma disposistion and tissue uptake[J].J Cardiovasc Pharmacol,2006,47:55-59.

[16]ZOLK O,JACOBI J,PAHL A,et al.MDR1 genotype-dependent regulation of the aldosterone system in humans[J].Pharmacogenet Genomics,2007,17:137-144.

[17]AMEYAW M M,REGATEIRO F,LI T,et al.MDR1 pharmacogenetics:frequency of the C3435T mutation in exon 26 is significantly influenced by ethnicity[J].Pharmcogenetics,2001,11: 217-221.

[18]WENJ,HUANGZ J,YUANH,etal.Theeffectof CYP3A4*1G,CYP3A5*3 and MDR1 C3435T gene polymorphism on antihypertensive effect of amlodipine in hypertensive patients after renal transplantation[J].Clin J Arterioscler,2011, 19(1):55-60.

（童颖丹编辑）

中图分类号：R 544.1；R 692

文献标识码：A

DOI:10.3969/j.issn.1005-8982.2016.13.010

文章编号：1005-8982（2016）13-0052-06

收稿日期：2015-09-06

*基金项目：海南省海口市重点科技项目（No：2013-61）

Relationship ofMDR1polymorphism with efficacy of calcium channel blockers in treatment of Chinese end-stage renal disease patients*

Jun Zhou，Ju Chen，Yong-mei Yang，Miao-xia Pan
（Department of Nephrology，Haikou People's Hospital，Haikou，Hainan 570208，China）

Abstract:Objective To evaluate the association of multidrug resistance gene 1（MDR1）polymorphism with the effectiveness of calcium channel blockers（CCB）therapy in end-stage renal disease（ESRD）patients. Methods The distribution ofMDR1polymorphism were investigated in 215 ESRD patients from Haikou Xiangya Hospital of Central South University using polymerase chain reaction and bidirectional sequencing.Multiple linear regression was used to analyze the association between polymorphisms and efficacy of CCB. Results TheMDR1 genotype distribution was in Hardy-Weinberg equilibrium.The patients in the standard hypertension group who carried the CT allele had a higher serum creatinine level（P =0.020）when compared to those who carried TT and CC genotypes（P ＜0.05）.There was no significant correlation betweenMDR1 C3435T genotypes and efficacy of CCB（P ＞0.05）.ConclusionsMDR1 polymorphism may not associate with the effectiveness of CCB therapy in ESRD patients.The patients who carry the CT allele have a higher serum creatinine level in the standard hypertension group.Further studies are necessary to validate our findings and to examine whether patients with CT genotype have predisposition to ESRD.

Keywords:multidrug resistance；end-stage renal disease；calcium channel blocker