莪术醇联合氟尿嘧啶对裸鼠胃癌移植瘤生长、增殖细胞核抗原和P27表达的影响*

王冬，范立侨，马希中，李勇，赵群，檀碧波，张志栋，崔平

（1.河北医科大学第四医院 外三科，河北 石家庄 050011；2.河北省人民医院 医务处，河北 石家庄 050051）



莪术醇联合氟尿嘧啶对裸鼠胃癌移植瘤生长、增殖细胞核抗原和P27表达的影响*

王冬1，范立侨1，马希中1，李勇1，赵群1，檀碧波1，张志栋1，崔平2

（1.河北医科大学第四医院 外三科，河北 石家庄 050011；2.河北省人民医院 医务处，河北 石家庄 050051）

摘要：目的观察莪术醇联合氟尿嘧啶对胃癌裸鼠皮下移植瘤的影响。方法将人胃癌细胞株BGC823接种于裸鼠皮下建立荷瘤裸鼠模型。将荷瘤裸鼠随机分为对照组、莪术醇组、氟尿嘧啶组、联合用药组（莪术醇联合氟尿嘧啶），记录各组的肿瘤体积和瘤重。应用荧光定量聚合酶链反应（qPCR）和免疫组织化学法检测各组肿瘤组织中增殖细胞核抗原（PCNA）、P27的表达。结果对照组肿瘤体积和重量比其他3组升高（P<0.05）；联合用药组肿瘤体积和重量低于莪术醇组（P<0.05）；联合用药组肿瘤体积和重量与氟尿嘧啶组比较，差异无统计学意义（P>0.05）。各实验组肿瘤组织中PCNA的表达均低于对照组（P<0.05）；与莪术醇组和氟尿嘧啶组比较，联合用药组PCNA的表达降低（P<0.05）。各实验组移植瘤组织中P27的表达均高于对照组（P<0.05）；与莪术醇组比较，联合用药组P27的表达增强（P<0.05）；与氟尿嘧啶组比较，联合用药组P27 mR NA的相对表达有升高趋势，但差异无统计学意义（P>0.05）。与莪术醇组和氟尿嘧啶组比较，联合用药组P27蛋白阳性率升高（P<0.05）。结论莪术醇联合氟尿嘧啶能抑制胃癌裸鼠皮下移植瘤的生长，其机制可能与调节PCNA、P27基因有关。

关键词：莪术醇；胃癌；裸鼠皮下移植瘤；增殖细胞核抗原；P27

胃癌是我国常见的消化系统恶性肿瘤之一，其发病率和死亡率都居恶性肿瘤前列。目前胃癌的治疗是以根治性手术为主，术后辅以化疗，而化疗的毒副作用以及对机体的免疫抑制作用，严重影响患者的生活质量，故近年来中药在胃癌的辅助治疗中占有越来越重要的地位[1-2]。莪术醇，又称姜黄环奥醇，是从中药莪术挥发油中提取的主要有效成分。已有研究表明，莪术醇对结肠癌、肺癌、胃癌、骨肉瘤细胞均有明显的抑制作用[2-5]，因而有望用于胃癌治疗。但迄今莪术醇抑制胃癌生长的体内研究还不多见，与其他化疗药物联合应用效果如何报道也没有一致意见。笔者以人胃癌BGC823细胞裸鼠皮下移植瘤动物模型作为研究对象，分别给予莪术醇、氟尿嘧啶及莪术醇联合氟尿嘧啶药物干预，研究不同措施对胃癌裸鼠移植瘤的影响，并检测增殖相关基因增殖细胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen，PCNA）、P27的表达，为莪术醇治疗胃癌的临床应用提供实验依据。

1　材料与方法

1.1材料

1.1.1实验药品莪术醇（中国食品药品检定研究院，纯度>99%），氟尿嘧啶注射液（江苏恒瑞医药股份有限公司，250mg/支），RPMI 1640培养基（洛斯维·帕克纪念研究所），胎牛血清（杭州四季青公司），胰蛋白酶（美国Gibco公司）,逆转录试剂盒购自美国Promega公司，荧光定量聚合酶链反应（quantitative polymerase chain reaction，qPCR）引物由上海捷瑞生物工程有限公司合成,鼠抗人PCNA、P27单克隆抗体（美国Santa Cruz公司），免疫组织化学法试剂盒购自北京中杉生物公司。

1.1.2细胞株人胃癌细胞株BGC823购自中国科学院上海细胞研究所，细胞在含有10%牛清及青链霉素抗体的RPMI 1640培养基中常规培养。

1.1.3实验动物4周龄BALB/c-nu雄性裸鼠，体重18～23 g，购自北京华阜康生物公司，合格证号：11401300017187，在河北医科大学第四医院动物中心无特定病原体（specefic pathogen free，SPF）级环境下饲养。动物室光照充足，温度26～28℃，相对湿度40%～60%。

1.2荷瘤裸鼠模型的建立

收集对数生长期BGC823细胞，调整细胞浓度为5×106个/ml的细胞悬液，无菌条件下将细胞悬液以0.2ml/只接种于裸鼠右前肢腋窝皮下，继续饲养2周，建立荷瘤裸鼠模型。

1.3动物分组与给药

待裸鼠皮下瘤生长至直径大约10 mm时进行分组。20只裸鼠随机分为4组：对照组（等容积生理盐水）、莪术醇组（莪术醇注射液100 mg/kg）、氟尿嘧啶组（氟尿嘧啶注射液50 mg/kg）、联合用药组（莪术醇注射液100mg/kg和氟尿嘧啶注射液50 mg/kg），每组5只。均每隔4天瘤体内给药1次，连续给药4次。

1.4肿瘤抑瘤率的比较

末次给药4d后脱颈处死裸鼠，完全剥取瘤体组织，测量肿瘤最长径A（mm）和最短径B（mm），体积（mm3）=1/2（A×B2），体积抑制率=（对照组瘤体积-实验组瘤体积）/对照组瘤体积×100%。电子天平称重瘤块，按照公式计算肿瘤抑制率。重量抑制率=（对照组瘤重-实验组瘤重）/对照组瘤重×100%。

1.5形态学观察

取部分剥离的瘤组织以10%中性甲醛固定，石蜡包埋，制成4μm厚的切片，苏木精-伊红染色法（hematoxylin-eosin staining，HE）染色，光镜下观察瘤组织细胞形态。

1.6qPCR检测PCNA、P27 mRNA表达

Trizol试剂提取各组裸鼠皮下移植瘤组织的总RNA，具体操作按试剂盒说明书进行。提取后以紫外光度计测定其纯度并定量。在PCR管中配制逆转录反应液，轻轻混匀，室温放置10 min后移入42℃恒温槽中，42℃保温1 h进行逆转录反应，反应结束后在冰水中冷却2min，所得反应液用于PCR反应。引物序列如下：PCNA正向引物为5'-GCCGAGATCTC AGCCATATT-3'，反向引物为5'-ATGTACTTAGAGG TACAAAT-3'；P27正向引物为5'-CCGACGATTCTT CTACTC-3'，反向引物为5'-CTGATAAACAAGGAAA CT-3'；甘油醛 -3-磷酸脱氢酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）正向引物为5'-AGAAGGCTGGGGCTCATTTG-3'，反向引物为5'-AGGGGCCATCCACAGTCTTC-3'。取逆转录产物5μl为PCR反应模板，反应体系为20μl。扩增条件：①PCNA。94℃预变性5min，95℃变性30s，58℃退火30 s，72℃延伸30 s，共40个循环，72℃继续延伸5 min。②P27，94℃预变性5 min，95℃变性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸30 s，共40个循环，72℃继续延伸5min。以上循环进行40次，扩增完毕后进行结果分析。

1.7免疫组织化学法检测PCNA和P27蛋白的表达

肿瘤组织置于10%中性甲醛中固定24 h，经脱水、透明、渗蜡、石蜡包埋，以4μm厚度连续切片后行免疫组织化学染色，方法参照试剂盒说明书。免疫组织化学结果判断：在每张切片中随机选取6个不同视野，在高倍镜下观察，以此来评判肿瘤细胞染色的着色率。PCNA蛋白阳性染色在胞核，P27蛋白阳性染色在胞浆，以出现淡黄色至棕黄色颗粒沉着为阳性。以高倍镜下计数100个细胞中阳性细胞所占百分比为阳性表达率，取6个视野的平均值。病理结果均由病理医师盲法评定。

1.8统计学方法

采用SPSS 13.0统计软件进行数据分析，计量资料以均数±标准差（x±s）表示，各组不同时间点细胞活性比较用重复测量方差分析，用SNK法进行两两比较；计数资料以率或百分比表示，用χ2检验，P< 0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1各组裸鼠肿瘤生长情况

裸鼠荷瘤生长结果表明，对照组、莪术醇组、氟尿嘧啶组、联合用药组的肿瘤体积分别为（2195.83± 54.00）、（1 795.48±56.86）、（1 439.50±31.13）和（1 363.40±37.54）mm3。4组体积比较，经方差分析，差异有统计学意义（F=434.291，P=0.000）。莪术醇组、氟尿嘧啶组、联合用药组肿瘤终体积与对照组比较，经t检验，差异有统计学意义（t=11.416、27.133和28.303，P=0.000）。4组肿瘤体积抑制率比较，经χ2检验，差异有统计学意义（χ2=51.591，P= 0.000）。莪术醇组、氟尿嘧啶组、联合用药组肿瘤体积抑制率与对照组比较，经χ2检验，差异有统计学意义（χ2=20.095、41.604和46.761，P=0.000）。

对照组、莪术醇组、氟尿嘧啶组、联合用药组的肿瘤重量分别为（1.88±0.09）、（1.51±0.09）、（1.18± 0.02）和（1.05±0.10）g。4组重量比较，经方差分析，差异有统计学意义（F=92.040，P=0.000）。莪术醇组、氟尿嘧啶组、联合用药组肿瘤重量与对照组比较，经t检验，差异有统计学意义（t=6.500、16.978和13.795，P=0.000）。4组重量抑制率比较，经χ2检验，差异有统计学意义（χ2=58.659，P=0.000）。莪术醇组、氟尿嘧啶组、联合用药组肿瘤重量抑制率与对照组比较，经χ2检验，差异有统计学意义（χ2=21.828、38.735和56.657，P=0.000）。见表1、2和图1。

表1　各组的肿瘤体积、重量比较 （n=5±s）

表1　各组的肿瘤体积、重量比较 （n=5±s）

注：1）与对照组比较，P<0.05；2）与莪术醇组比较，P<0.05

组别　移植瘤平均重量/g对照组　2195.83±54.00　1.88±0.09莪术醇组　1795.48±56.861）　1.51±0.091）肿瘤终体积/mm3氟尿嘧啶组联合用药组1439.50±31.131）1363.40±37.541）2）1.18±0.021）1.05±0.101）2）F值　434.291　92.040 P值　0.000　0.000

2.2各组肿瘤细胞活性情况（MTT结果）

重复测量的方差分析结果显示，各组肿瘤细胞活性与处理方式及时间都有关系。各组间细胞活性不同，差异有统计学意义（F组间=21.582，P组间=0.000）；各组细胞随时间延长活性逐渐升高，差异有统计学意义（F时间=340.020，P时间=0.000）；不同处理措施和时间之间存在交互作用（F交互=4.061，P交互=0.000）。见表3。

表2　各组的肿瘤体积和肿瘤重量抑制率比较（n=5，%）

2.3PCNA、P27 mRNA在各组裸鼠胃癌组织中的表达

qPCR结果显示，各组PCNAmRNA的相对表达量不同，差异有统计学意义（F=102.272，P=0.000）。莪术醇组、氟尿嘧啶组、联合用药组裸鼠胃癌移植瘤组织中PCNAmRNA的相对表达量均低于对照组，差异有统计学意义（t=3.668、6.692和14.189，P= 0.006、0.000和0.000）。各组P27 mRNA的相对表达量不同，差异有统计学意义（F=35.163，P=0.000）。莪术醇组、氟尿嘧啶组、联合用药组P27 mRNA的相对表达量均高于对照组，差异有统计学意义（t= -5.065、-7.837和9.334，P=0.000）。

图1　各组裸鼠皮下移植瘤情况

表3　各组肿瘤细胞活性情况 （n=5±s）

表3　各组肿瘤细胞活性情况 （n=5±s）

注：†与对照组比较，P<0.05。F组间=21.582，P组间=0.000；F时间=340.020，P时间=0.000；F交互=4.061，P交互=0.000

组别0h 24h 48h 72h对照组　0.129±0.023　0.236±0.045　0.512±0.056　0.702±0.051莪术醇组　0.131±0.019　0.232±0.041　0.416±0.068†　0.623±0.058†氟尿嘧啶组　0.126±0.020　0.238±0.037　0.382±0.069†　0.562±0.061†联合用药组　0.128±0.021　0.234±0.050　0.358±0.067†　0.519±0.082†

图2　P27蛋白在各组肿瘤组织中的表达 （免疫组织化学法×400）

各组PCNA蛋白的相对表达量不同，差异有统计学意义（F=177.139，P=0.000）。莪术醇组、氟尿嘧啶组、联合用药组PCNA蛋白表达低于对照组，差异有统计学意义（t=10.835、23.333和24.741，P=0.000）。各组P27蛋白的相对表达量不同，差异有统计学意义（F=541.010，P=0.000）；莪术醇组、氟尿嘧啶组、联合用药组P27蛋白的相对表达量均高于对照组，差异有统计学意义（t=-12.623、-19.194和-25.839，P=0.000）。见图2、3和表4、5。

图3　PCNA蛋白在各组肿瘤组织中的表达 （免疫组织化学法×400）

表4　各组PCNA和P27 mRNA的表达情况 （n=5±s）

表4　各组PCNA和P27 mRNA的表达情况 （n=5±s）

注：1）与对照组比较，P<0.05；2）与莪术醇组比较，P<0.05；3）与氟尿嘧啶组比较，P<0.05

组别PCNAmRNA P27mRNA对照组　1.0015±0.0682　1.010±0.1746莪术醇组　0.8673±0.04521）　1.8307±0.31751）F值　102.272　35.163 P值　0.000　0.000氟尿嘧啶组联合用药组0.7553±0.04601）0.5327±0.02841）2）3）2.0274±0.23191）2.5566±0.32681）2）

表5　各组PCNA和P27蛋白的表达情况 （n=5±s）

表5　各组PCNA和P27蛋白的表达情况 （n=5±s）

注：1）与对照组比较，P<0.05；2）与莪术醇组比较，P<0.05；3）与氟尿嘧啶组比较，P<0.05

组别PCNA蛋白P27蛋白对照组　0.7356±0.0226　0.3367±0.0236莪术醇组　0.5694±0.02581）　0.5106±0.01981）F值　177.139　541.010 P值　0.000　0.000氟尿嘧啶组联合用药组0.4405±0.01701）0.4017±0.02901）2）0.6028±0.02011）0.7167±0.02291）2）3）

3　讨论

胃癌是常见的恶性肿瘤之一，但我国早期胃癌仅占所有胃癌患者的10%左右[6]。由于早期胃癌无明显症状及缺乏特异性的筛选指标，因此多数患者就诊时已处于中晚期，手术效果不佳或失去手术机会。此时，以化疗为主的综合治疗对提高患者的生存期起着重要的作用，氟尿嘧啶等嘧啶类药物是胃肠道等多种肿瘤治疗的一线药物，用其化疗有许多毒副作用，使得患者难于耐受而放弃或不能坚持治疗。因此，寻找减轻化疗毒物作用、提高生活质量的方法或药物就有着重要意义。中药提纯物作为胃癌治疗的辅助用药已广泛应用于临床，可减轻化疗毒副作用，提高患者生存质量，对化疗药具有增效增敏作用。

莪术醇是中药莪术的主要有效成分，已被证实对多种疾病的治疗有效。研究表明，莪术醇能明显抑制结肠癌、肺癌、胃癌、骨肉瘤细胞的生长[2-5]。但该类研究以体外实验为多，有关莪术醇体内治疗胃癌的效果研究还不多见。本研究中笔者对莪术醇体内抑制胃癌生长的作用机制进行分析，结果显示，莪术醇对裸鼠皮下移植瘤的生长有明显的抑制作用，莪术醇作用后肿瘤的体积和重量都受到明显抑制，说明莪术醇有明显的抗癌效果。结果还发现莪术醇和氟尿嘧啶联合应用效果更为显著，提示莪术醇与氟尿嘧啶在胃癌治疗中可能具有协同作用，在临床联合应用莪术醇和氟尿嘧啶有望提高化疗效果。

为探讨莪术醇抑制胃癌生长的机制，笔者进一步检测各组肿瘤组织中PCNA、P27的表达情况。PCNA合成量在细胞周期的G1期逐渐增加，到S期达高峰，G2期开始下降，与细胞DNA的合成密切相关，在细胞增殖周期中起着重要作用，其表达量与DNA合成量变化一致，是直接反映细胞增殖能力的指标[7]。P27可以与周期素依赖性蛋白激酶结合，对细胞周期进行调控，为重要的细胞周期负性调控因子，其缺失与肿瘤的发生和发展有着重要关系[8]。本研究结果显示，莪术醇作用后可以明显抑制PCNA的表达，同时促进P27表达，提示莪术醇可能通过调控上述基因而抑制胃癌生长。但肿瘤的生长机制复杂，本研究仅检测莪术醇作用后两种基因的改变，且没有进行深入的机制研究，这是明显不足的，需要进一步的深入研究确定莪术醇抗胃癌的具体机制。

本研究显示莪术醇可以抑制裸鼠胃癌移植肿瘤的生长，且与氟尿嘧啶具有协同作用，其机制可能莪术醇与下调PCNA而上调P27基因有关。本研究为莪术醇胃癌应用提供一定依据，但本研究内容较为简单，还有待进一步的分子实验和临床实验予以证实。

参考文献：

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[4]张弘,张连荣,姜海军,等.莪术醇对人胃癌细胞株BGC823增殖的影响及其机制[J].中华实验外科杂志,2015,32(10):2444-2447.

[5]马琨,胡国强.莪术醇诱导人骨肉瘤MG63细胞自噬的实验研究[J].中成药,2015,37(2):268-272.

[6]LI Y,ZHAO Q,FAN L Q,et al.Analysis of lymph node dissection range-related factors for early gastric cancer operation[J]. Hepato-Gastroenterology,2013,60(125):971-974.

[7]LI N,DENG W,MA J,et al.Prognostic evaluation of nanog, Oct4,Sox2,PCNA,Ki67 and E-cadherin expression in gastric cancer[J].Med Oncol,2015,32(1):433.

[8]LEE S R,SHIN J W,KIM H O,et al.Determining the effect of transforming growth factor-β1on cdk4 and p27 in gastric cancer and cholangiocarcinoma[J].Oncol Lett,2013,5(2):694-698.

（申海菊编辑）

中图分类号：R 735.2

文献标识码：A

DOI:10.3969/j.issn.1005-8982.2016.13.001

文章编号：1005-8982（2016）13-0001-06

收稿日期：2015-12-28

*基金项目：国家自然基金面上项目（No：81372580）；河北省中医药管理局项目（No：2014145D）

［通信作者］李勇，E-mail：li_yong_hbth@126.com；Tel：0311-86095678

Effect of curcumol combined with fluorouracil on growth of gastric cancer implantation tumor in nude mice and expressions ofPCNA andP27genes*

Dong Wang1，Li-qiao Fan1，Xi-zhong Ma1，Yong Li1，Qun Zhao1，Bi-bo Tan1，Zhi-dong Zhang1，Ping Cui2
（1.The Third Department of General Surgery，the Fourth Affiliated Hospital，Hebei Medical University，Shijiazhuang，Hebei 050011，China；2.Division of Medical Affairs，Hebei General Hospital，Shijiazhuang，Hebei 050051，China）

Abstract:Objective To observe the effect of curcumol combined with fluorouracil（FU）on subcutaneous transplantation tumor tissues of gastric cancer cells in nude mice.Methods The implantation tumor model was built by subcutaneous inoculation of human gastric cancer cell line BGC823 in nude mice.The tumor-bearing mice were randomly divided into control group，curcumol group，FU group and combination group（curcumol combined with FU）.Data of tumor volume and weight of each group were collected.Expressions ofPCNAandP27genes in tumors of the 4 groups were detected with qPCR and immunohistochemistry.Results The tumor volume was significantly smaller and the tumor weight was significantly lower in the 3 experimental groups than in the control group（P＜0.05）.Compared with the curcumol group，the tumor volume was significantly smaller and the tumor weight was significantly lower in the combined group（P＜0.05）.The volume and weight of the tumors had no significant differences between the FU group and the combined group（P＞0.05）.The expression of thePCNAin the experimental groups was significantly lower than that in the control group（P＜0.05）.Compared with the curcumol group and the FU group，the expression ofPCNAin tumor tissues of the combined group significantly decreased（P＜0.05）.The expression of theP27in the 3 experimental groups was significantly higher than that in the control group（P＜0.05）. Compared with the curcumol group，the expression ofP27in the combined group significantly increased（P＜0.05）. There was no significant difference inP27mRNA of tumor tissues between the combined group and the FU group（P＞0.05）.The positive percentages of p27 protein in the 3 experiment groups were significantly higher than that in the control group（P＜0.05）.Compared with the curcumol group and the fluorouracil group，the positive percentages of PCNA protein in the combined group was significantly higher（P＜0.05）.Conclusions Curcumol combined with FU could inhibit the growth of subcutaneous transplantation tumor of human gastric cancer cells in nude mice，which might be related to regulation ofPCNAandP27genes.

Keywords:curcumol；gastric cancer；subcutaneous transplantation tumor of nude mice；proliferating cell nuclear antigen；P27