糖原合成酶激酶3β介导心房钠尿肽对H9c2心肌细胞线粒体保护作用的研究*

洪兰，洪英姬，金红花

（1.延边大学医学院 生理学与病理生理学教研部，吉林 延吉 133002；2.延边大学附属医院 药学部，吉林 延吉 133000）



论著

糖原合成酶激酶3β介导心房钠尿肽对H9c2心肌细胞线粒体保护作用的研究*

洪兰1，洪英姬1，金红花2

（1.延边大学医学院 生理学与病理生理学教研部，吉林 延吉 133002；2.延边大学附属医院 药学部，吉林 延吉 133000）

摘要：目的探讨心房钠尿肽（ANP）对H9c2心肌细胞缺血再灌注损伤的保护作用机制。方法采用四甲基罗丹明乙酯（TMR E）荧光染料和激光共聚焦显微镜成像技术测定H9c2心肌细胞TMR E荧光强度的变化，即线粒体膜通透性转换孔（mPTP）开放程度。利用双氧水H2O2诱导H9c2心肌细胞线粒体mPTP的开放，预处理不同浓度的ANP后，观察ANP对mPTP开放的影响；同时利用Western blot检测H9c2心肌细胞的糖原合成酶激酶3β（GSK-3β Ser9）磷酸化程度，即失活程度。利用激活型GSK-3β质粒转染的H9c2心肌细胞（GSK-3β-S9A-HA），来观察ANP对GSK-3β-S9A-HA的线粒体mPTP开放程度。结果与对照组（600μmol/L H2O2）比较，0.01、0.10、1.00和10.00nmol/L ANP明显抑制H2O2对TMR E荧光强度的衰减效应（P<0.05），其中1.00 nmol/L的ANP效应最强。Western blot检测结果显示，0.01、0.10、1.00和10.00 nmol/L ANP明显增强GSK-3β Ser9的磷酸化（P<0.05），即抑制GSK-3β的活性。利用GSK-3β-S9A-HA后发现，ANP（1.0nmol/L）不能抑制mPTP开放（与H9c2比较P<0.05）。结论ANP通过调节GSK-3β活性来抑制H9c2心肌细胞mPTP的开放，从而保护H9c2心肌细胞的缺血再灌注损伤。

关键词：心房钠尿肽；缺血再灌注；线粒体膜通透性转移孔；糖原合成酶激酶3β

心房钠尿肽（atrial natriuretic peptide，ANP）是由心房肌细胞合成和分泌的肽类激素。ANP对缺血再灌注损伤具有较好的保护作用。在大鼠离体心脏灌流模型中，ANP可以增加再灌注心脏的心输出量，减少缺血再灌注心脏的心梗面积，对急性心肌梗死患者静脉注射ANP能减轻缺血再灌注造成的心脏损伤[1]，但ANP发挥心肌保护作用的具体机制尚未清楚。线粒体膜通透性转换孔（mitochondrial permeability transition pore，mPTP）的开放是导致缺血再灌注损伤的关键因素[2]，防止mPTP的开放是减轻再灌注损伤的有效手段，抑制mPTP的开放是一些心脏保护类药物，如腺苷，抗缺血再灌注损伤的共同作用机制。糖原合成酶激酶3β（glycogen synthase 3β，GSK-3β）是真核生物中普遍存在的一种多功能丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，静息时GSK-3β保持激活状态。GSK-3β的丝氨酸（Serine，Ser9）位点磷酸化使GSK-3β活性降低。研究发现，抑制GSK-3β的活性可以有效抑制mPTP的开放[3]。但是，ANP保护缺血再灌注损伤机制与GSK-3β活性和mPTP的开放是否有关，尚不清楚。本研究采用激光共聚焦显微成像技术和Western blot检测，观察ANP是否通过降低GSK-3β的活性而抑制mPTP的开放，起到抵制缺血再灌注损伤的作用，拟探讨ANP的心肌保护作用机制。

1　材料与方法

1.1实验试剂及仪器

大鼠胚胎心脏组织来源的H9c2细胞株（美国ATCC菌种收藏中心），ANP、细胞培养所用的达尔伯克必需基本培养基、胎牛血清、0.25%胰蛋白酶等（美国Gibco公司），GSK-3β-S9A-HA（美国宾夕法尼亚大学医学院），四甲基罗丹明乙酯（tetramethylrhodamine ethylester，TMRE）荧光染料（美国Invitrogen公司），Western blot检测凝胶试剂盒（北京索莱宝 公 司），抗 磷酸化的 GSK-3α/β（Phospho-GSK-3α/β，Ser21-GSK-3α/Ser9-GSK-3β）抗体以及α-actin抗体（美国Cell Signaling Technology公司）。

实验中主要仪器有FV-1000激光共聚焦显微镜（日本Olmpus公司），JY200C电泳系统（北京君意东方电泳设备有限公司），680型酶标仪（美国Bio-Red公司），ChampGel 6000凝胶成像分析系统（北京赛智创业科技有限公司），5430R台式低温离心机（德国Eppendorf公司）。

1.2线粒体膜电位的测定及实验分组

TMRE荧光探针是一种带正电荷、可透过细胞膜的无毒性荧光染料，其激发光波长为543 nm，发射波长为560 nm。在正常生理条件下，线粒体膜电位（mitochondrial membrane potential，MMP）保持内负外正的状态。由于该电压差使正电的TMRE可迅速地进入并聚集在线粒体内。mPTP的开放使得氢离子等进入细胞，造成MMP消失，MMP降低是mPTP开放的象征，从而导致TMRE从线粒体释放。所以线粒体内TMRE荧光强度变化能较为准确地显示MMP的高低和mPTP的开放。故利用激光共聚焦显微镜成像技术检测线粒体内TMRE荧光强度值的变化值，可推测线粒体膜电位的变化，从而可以测定线粒体mPTP的开放。本实验利用双氧水H2O2诱导H9c2的缺血再灌注损伤，TMRE荧光强度减少至<50%基础值则认为诱导缺血再灌注损伤成功。

H9c2分成7组，用H2O2（终浓度600μmol/L）在37℃孵育箱内孵育20 min，诱导H9c2氧化应激损伤。H9c2分成两组，对照组：H2O20min+H2O220min；ANP组：ANP（终浓度 0.001、0.010、0.100、1.000、10.000和100.000nmol/L）20min+H2O220min。各组以每10 min间隔扫描图片，并用定量分析软件测定荧光强度值。

1.3GSK-3β质粒DNA的转染及实验分组

GSK-3β质粒（GSK-3β-S9A-HA）采用Fugene6转染试剂盒进行转染，所有实验在转染48 h内进行[5]。对照组：H2O 20min+H2O2（终浓度600μmol/L）20 min；ANP组：ANP（终浓度1 nmol/L）20 min+H2O220min；S9A组：转染激活型GSK-3β质粒的H9c2细胞+H2O 20 min+H2O2（终浓度600μmol/L）20 min；S9A/ANP组：转染激活型GSK-3β质粒的H9c2细胞+ANP（终浓度1 nmol/L）20 min+H2O220 min。各组以每10 min间隔扫描图片，并用定量分析软件测定荧光强度值。

1.4Western blot检测GSK-3β磷酸化水平

采用终浓度为0.001、0.010、0.100、1.000、10.000 和100.000 nmol/L ANP预处理H9c2细胞20 min，常规Western blot检测GSK-3β Ser9位点的磷酸化，从而观察GSK-3β的活性。其最终数据表示为（目的蛋白/内参蛋白）/（对照组蛋白/对照组内参蛋白）×100%。

1.5统计学方法

采用Prism 3.0统计软件进行数据处理，计量资料以均数±标准差（±s）表示，多组间均数比较用单因素方差分析（one-way ANOVA）和LSD-t检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1ANP对线粒体mPTP开放的影响

对照组利用600μmol/L H2O2处理H9c2细胞20 min后，TMRE荧光强度明显减少至基础值的（36.75±3.87）%，即H2O2可以明显诱导缺血再灌注损伤。不同浓度的ANP预处理H9c2心肌细胞20min后发现，0.01、0.10、1.00和10.00nmol/L ANP均抑制H2O2减少TMRE荧光强度的效应（P<0.05），而浓度0.001nmol/L和最高浓度100.000nmol/L ANP未能抵制H2O2对MMP的衰减作用。ANP防止mPTP开放的有效浓度范围为0.01～10.00 nmol/L。见表1和图1。

表1　不同浓度的ANP对TMRE荧光强度的影响（n=6±s）

表1　不同浓度的ANP对TMRE荧光强度的影响（n=6±s）

注：1）与对照组比较，P<0.05；2）与对照组比较，P<0.01 ANP（/nmol/L）

20min对照组　100.0±0.0　36.8±3.9 ANP（0.001nmol/L）　100.0±0.0　51.8±9.0 ANP（0.010nmol/L）　100.0±0.0　52.0±2.41）ANP（0.100nmol/L）　100.0±0.0　75.1±1.02）ANP（1.000nmol/L）　100.0±0.0　78.5±11.02）ANP（10.000nmol/L）　100.0±0.0　75.9±14.51）ANP（1000.000nmol/L）　100.0±0.0　50.4±14.3 F值P值组别0min 2.820 0.023

图1　不同浓度ANP预处理后各组TMRE荧光强度比较 （×120）

2.2ANP对GSK-3β活性的影响

0.01～100.00nmol/L ANP均明显增加GSK-3β Ser9的磷酸化水平，即可以明显抑制GSK-3β的活性，其中1.0 nmol/L ANP效果最明显，只有最低浓度ANP（0.001 nmol/L）对GSK-3β磷酸化没有影响。该有效浓度范围与ANP对mPTP抑制作用的有效浓度范围基本一致。见图2和表2。

2.3ANP对转染GSK-3β质粒的H9c2细胞mPTP开放的影响

对照组、ANP组、S9A组、S9A/ANP组经20 min H2O2处理后，各组TMRE荧光强度分别减少至基础值的（36.75±3.87）%、（78.47±11.00）%、（35.32± 5.49）%和（39.95±4.51）%，差异有统计学意义（F= 8.830，P=0.000），ANP组TMRE荧光强度高于对照组、S9A组及S9A/ANP组（t=3.576、3.520和3.247，P=0.003、0.003和0.006）。而S9AANP组的TMRE荧光强度与S9A对照组比较，差异无统计学意义（P> 0.05）。见图3。

图2　不同浓度ANP对GSK-3β磷酸化的影响

图3　各组TMRE荧光强度比较 （×120）

表2　ANP对GSK-3β磷酸化的影响 （n=6±s）

表2　ANP对GSK-3β磷酸化的影响 （n=6±s）

注：1）与对照组比较，P<0.05；2）与对照组比较，P=0.000

Phosphor-GSK-3β对照组　100.00±0.00 ANP（0.001nmol/L）　124.80±15.26 ANP（0.010nmol/L）　146.40±15.021）ANP（0.100nmol/L）　188.60±19.482）ANP（1.000nmol/L）　225.60±21.042）ANP（100.000nmol/L）　184.10±20.311）ANP（1000.000nmol/L）　151.10±20.701）F值P值组别6.886 0.000

3　讨论

心肌缺血再灌注损伤是治疗缺血性心脏病过程中面临的最棘手的医学问题[6]。虽然介入和搭桥手术等目前先进的医疗手段能够改善缺血带来的损伤，但由于冠状动脉再通后容易引起再灌注损伤，急性心肌梗死的治疗难度和死亡率依然很高。目前动物实验显示，再灌注期给予几种药物，如腺苷，可以改善缺血再灌注损伤，但临床试验结果均不理想[7]，究其原因是还未完全了解保护再灌注损伤的作用机制[8]。研究认为，心肌缺血再灌注时，mPTP持续性开放是导致再灌注损伤的重要原因[2]，因此抑制mPTP的开放是防止再灌注损伤的关键。有研究发现，预先反复短暂缺血（缺血预处理）可以提高心肌组织对随后持续缺血的耐受性，减少心肌梗死面积，减少心律失常发生，而缺血预处理保护心肌细胞的作用机制就是通过抑制mPTP的开放而减轻再灌注损伤[9]。

ANP最早发现的生物学作用是排钠利尿，而近年来的研究证实，ANP在许多缺血缺氧相关性疾病如急性心肌梗死、充血性心力衰竭、慢性阻塞性肺疾病中保持高分泌状态，并且在该类疾病中分泌的ANP可以发挥抵制心肌肥大[10]、氧化应激[11]、保护缺血再灌注损伤等作用[12]。在本研究中，0.01、0.10、1.00、10.00 nmol/L ANP可以明显抑制H2O2诱导的H9c2细胞mPTP开放，提示ANP可能通过抑制线粒体mPTP的开放，抵制氧化应激伤的损伤，进而保护缺血再灌注的心脏。本实验室长期对大鼠ANP浓度测定结果显示，大鼠心房灌流液的ANP浓度一般在50～300 pg/ml，而本实验所用的ANP浓度已经超出大鼠灌流液当中的ANP生理浓度。本实验室前期研究还显示，大鼠心房缺氧时ANP浓度明显升高，并且升高至常氧时的5～10倍。故根据本实验的结果推测，缺氧缺血时增高的ANP可能起到抵制缺氧缺血等的生理学作用，从而保护缺氧缺血的心脏。

防止mPTP开放可以有效抵制心肌缺血再灌注损伤。而在抑制mPTP开放的具体信号机制中，目前普遍认为GSK-3β发挥重要的作用。研究发现，缺血预处理能够增加GSK-3β的磷酸化，而抑制GSK-3β的活性能模拟缺血预处理的心肌保护作用[13]，提示GSK-3β在心肌保护机制中发挥重要作用。JUHASZOVA等[14]认为，抑制GSK-3β的活性对阻止mPTP的开放可能发挥重要作用。在心肌细胞中，一些心脏保护类物质如腺苷[3]、酒精[15]和外源性锌[16]均通过抑制GSK-3β的活性而阻止mPTP的开放。本实验结果表明，ANP能够增加GSK-3βSer9的磷酸化，表明ANP能明显抑制GSK-3β的活性，并且有效浓度和最高效应浓度与ANP抑制mPTP开放的浓度值相吻合。进一步的实验表明，利用GSK-3β质粒转染的H9c2细胞（GSK-3β-S9A）观察发现，ANP未能抵制H2O2诱导GSK-3β-S9A的mPTP开放效应，说明ANP通过抑制GSK-3β的活性，从而抵制线粒体mPTP开放。综上所述，ANP具有保护缺血再灌注损伤作用，其作用机制是通过抑制增加GSK-3β的磷酸化而抑制GSK-3β的活性，从而防止mPTP开放，最终起到心肌保护作用。

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[16]CHANOIT G,LEE S,XI J,et al.Exogenous zinc protects cardiac cells from reperfusion injury by targeting mitochondrial permeability transition pore through inactivation of glycogen synthase kinase-3 beta[J].Am J Physiol Heart Circ Physiol,2008, 295(3):H1227-H1233.

（童颖丹编辑）

中图分类号：R 542.2

文献标识码：A

DOI:10.3969/j.issn.1005-8982.2016.13.002

文章编号：1005-8982（2016）13-0007-05

收稿日期：2015-12-21

*基金项目：国家自然科学基金（No：81260035）；吉林省卫生厅科研课题基金（No：2013300-612013111）

[通信作者]金红花，E-mail：kimflower1988@163.com；Tel：0433-2660788

Protective mechanism of ANP on mitochondria of H9c2 myocardial cells via GSK-3β*

Lan Hong1,Ying-ji Hong1,Hong-hua Jin2
（1.Department of Physiology and Pathophysiology，Medical College of Yanbian University，Yanbian，Jilin 133002，China；2.Department of Pharmacy，the Affiliated Hospital of Yanbian University，Yanbian，Jilin 133000，China）

Abstract:Objective To investigate protective mechanism of atrial natriuretic peptide（ANP）on H9c2 myocardial cell mitochondria via glycogen synthase kinase 3β（GSK-3β）.Methods The change of mitochondrial membrane potential was determined using fluorescent dye tetramethylrhodamine ester（TMRE）and laser confocal microscopy imaging technique.The open degree of mitochondrial permeability transition pore（mPTP）was reflected as TMRE fluorescence intensity and the GSK-3β Ser9 phosphorylation（deactivation degree）was detected by Western blot.Then the protective effect of ANP on H9c2 cells transfected with activated GSK-3β plasmid （GSK-3β-S9A-HA）was observed.Results Compared to the control group（600 μmol/L H2O2），0.01，0.10，1.00 and 10.00 nmol/L ANP significantly inhibited attenuation effect of TMRE fluorescence intensity induced by H2O2（P ＜0.05）；of which 1.00 nmol/L ANP had the strongest effect.It suggested that ANP may modulate the mPTP opening.Western blot result showed that 0.01，0.10，1.00，10.00 and 100.00 nmol/L ANP significantlyincreased the level of phosphorylation of GSK-3β（P＜0.05）；which indicated that ANP could inhibit the activity of GSK-3β；however，1.00 nmol/L ANP was not able to inhibit mPTP opening in cells of GSK-3β-S9AHA.Conclusions ANP prevents the mPTP opening by inactivating GSK-3β so as to protect H9c2 myocardial cells during ischemia-reperfusion injury.

Keywords:atrial natriuretic peptide；ischemia-reperfusion injury；mitochondrial permeability transition pore；glycogen synthase kinase 3β