MicroR N A-132在结肠癌中的表达及其临床意义

赵继明，彭健

（中南大学湘雅医院，湖南 长沙 410008）

MicroR N A-132在结肠癌中的表达及其临床意义

赵继明，彭健

（中南大学湘雅医院，湖南 长沙 410008）

目的探讨M i croRNA-132（m i R-132）在结肠癌中的表达及其临床意义。方法实时逆转录定量PC R和原位杂交分析结肠癌组织中m i R-132的表达情况。分析m i R-132表达与结肠癌临床病理参数和预后之间的相关性。结果m i R-132在结肠癌组织中的表达明显低于正常结肠黏膜组织（P＜0.01），m i R-132低表达与结肠癌分期更晚有关。多元回归分析表明，m i R-132低表达与结肠癌患者生存期更短有关（P＜0.01），m i R-132是结肠癌患者预后的独立预测因子。结论m i R-132表达下调能够促进结肠癌进展，是预测结肠癌患者预后的可靠指标，m i R-132也具有成为结肠癌靶向治疗靶点的潜力。

结肠癌；临床病理参数；m i R-132家族；预后

结肠癌是全球常见的发病率和致死率都很高的恶性消化道肿瘤［1］。研究证明结肠癌的发生、发展是一个多步骤、多阶段、多因素参与的过程。结肠癌的发生与饮食、环境等因素密切相关，并且，结肠癌的发生涉及到遗传突变，包括癌基因激活、抑癌基因失活、错配修复基因突变及基因过度表达等。

M i croRNAs（m i RNAs）是在秀丽隐杆线虫中发现的一类进化上保守、单链小分子非编码RNAs（17～25个核苷酸）。m i RNAs通过与其靶信使RNA转录子3'非翻译区互补结合调控基因表达［2］。m i RNA-132在肺癌［3］和胰腺内分泌肿瘤［4］中表达降低，而在神经胶质瘤［5］和胃癌中［6］的表达升高。不同肿瘤中m i RNA表达水平不同，提示m i RNAs在肿瘤细胞中功能不同，且m i RNA调控其潜在靶基因的方式十分复杂。目前尚未见m i R-132在结肠癌中作用研究的报道，本研究主要分析m i R-132表达与结肠癌患者预后之间的关系。

1　资料与方法

1.1研究对象

164例结肠癌组织标本均为湘雅医院2009年1 月-2012年12月结肠癌病例，均经手术治疗，手术前未经放化疗等其他治疗，经病理确诊均为结肠癌，患者年龄28～64岁，中位年龄（49±2.4）岁。平均随访期为38.1个月（6～58个月）。患者定期接受身体及超声检查，如有必要进行CT扫描。总生存期是指手术至死亡间隔时间。

1.2主要试剂

RNA提取试剂盒和Taqm an m i RNA检测试剂盒均购自美国Appl i ed Bi osyst em公司，DEPC购自美国Si gm a公司，乙醇、氯仿和异丙醇均购自北京化学试剂公司。

1.3R N A提取及逆转录实时定量聚合酶链反应

应用RNA提取试剂盒从结肠癌组织中提取RNA，采用Taqm an m i RNA试剂盒检测成熟体m i RNA-132的表达水平。内参校正：实时逆转录定量聚合酶链反应（real-t i m e reverse t ranscri pt i onquant i t at i vepol ym erasechai nrect i on，Real-t i m e RT-qPCR）。每个样品加样量约为10 ng，由于受到RNA浓度定量误差和RNA逆转录效率误差等的影响，每个样品的等体积cDNA含量并不完全相同，为了校正此误差，试验中以RNU6为内参。采用二步法检测m i RNA-93相对表达量。第1步，用茎环引物合成互补DNA。m i RNA逆转录采用10 ng总RNA 15μl逆转录反应体系，在PCR管中加入逆转录混合液7μl，浓度为2 ng/μl的总RNA 5μl，3μl特异性逆转录引物。轻轻混匀，在冰上放置5 m i n，逆转录反应16℃30 m i n，42℃保温30 m i n，85℃保温5 m i n，4℃保温5 m i n。第2步，采用20μl反应体系在ABI7300实时PCR仪中反应，反应体系为2×的Taq m an uni ve RsAl PCR通用混合液 10μl，20×的Taqm an m i RNA特异引物1μl，逆转录产物cDNA 4μl，加无RNA酶水5μl补充至体积20μl。循环条件为94℃预变性10 m i n，95℃变性15 s，60℃退火60 s，扩增40个循环后观察分析结果。所有的实时定量反应包括无模板的对照反应，均按ABI7300实时PCR仪说明书进行，实验中Ct检测值在20～32之外的进行第2次重复检测。应用公式2-Δct计算m i RNA-93的相对表达量。

1.4原位杂交检测结肠癌组织中m i R-132l的表达

结肠癌组织标本4 m m连续切片后，常规脱蜡脱水，H Cl于37℃反应20 m i n增加组织通透性，4%多聚甲醛（0.1m ol/L PBS溶解）室温条件下固定10 m i n，0.1 m ol/L TEA缓冲液Ⅰ［0.1 m ol/L三乙醇胺与乙酸酐混合液，浓度0.25%（体积比）］和TEA缓冲液Ⅱ［0.1 m ol/l，三乙醇胺与乙酸酐混合液，浓度0.5%（体积比）］杂交前处理以增加组织阳性杂交的强度。杂交：探针m i R-132用杂交液稀释至20 nm ol，滴加于组织切片上，45℃水浴锅内杂交18 h。杂交后用TI-kS溶液冲洗3次，每次10m i n，封闭液封闭25m i n（封闭非特异的抗体结合位点）。杂交后采用Ant i-Di goxi geni n-POD检测地高辛探针与m i RNA结合复合物，TSA放大系统增强原位杂交反应的阳性信号，NBT/BCIP显色，显微镜下控制显色反应，加核快红复染3 m i n，中性树胶封片。阳性对照和阴性对照：看家基因β-act i n的寡核苷酸探针做为每次杂交的阳性对照，不加探针的预杂交液做为每次实验阴性对照。结果判断：光学显微镜下对m i R-132在组织切片中每一组织点的表达进行综合观察判断。①根据阳性染色强度判断：细胞无染色为0分；细胞呈浅蓝色记1分；细胞染成蓝色并无背景染色，为中等阳性，记2分；细胞晕紫色，无背景着色，为强阳性，记3分。②根据阳性细胞数计分：无阳性细胞计0分；阳性细胞数≤30%计1分；30%～70%计2分；阳性细胞数＞70%计3分。取两种计分结果的乘积，0分为阴性，1、2、3、4、6及9分为阳性。其中1、2分计作弱阳性（+），3、4分计作阳性（++），6分计作强阳性（+++），9分计作强阳性（++++）。

1.5统计学方法

采用SPSS 19.0统计软件进行数据处理，计量资料以均数±标准差（±s）表示，采用单因素方差分析，LSD检验，比较m i R-132在结肠癌不同临床分期和病理分级的中表达差异。癌组织和正常组织比较，用独立样本t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1m i R N A-132在结肠癌组织中的表达水平

Real-t i m e R T-qPCR检测结果表明，m i R-132在结肠癌组织中的表达（1.48±0.27）明显低于正常结肠组织（4.64±1.21）差异有统计学意义（P=0.008）（见图1A、B）。

本研究进一步采用原位杂交分析方法验证了m i R-132在结肠癌组织和正常结肠组织中的表达类型和细胞定位情况。原位杂交分析结果表明m i R-132主要表达于细胞核，而在正常结肠组织中呈强阳性表达（见图2A、B和C）。统计分析发现，结肠癌组织中m i R-132的表达降低与正常结肠组织表达差异有统计学意义，该结果与Real-t i m e RT-qPCR结果一致，m i R-132在结肠癌组织中的表达明显低于正常结肠组织。

2.2m i R-132在结肠癌中表达降低与结肠癌临床病理特征的关系

将m i R-132原位杂交检测的中位值3.74作为164例结肠癌患者的分组阈值，其中m i R-132低表达组104例，高表达组60例，统计分析结果表明m i R-132低表达组肿瘤与分期和分级相关（见表1）。m i R-132表达与结肠癌的其他病理特征无关，如患者年龄、组织类型、肿瘤直径、化疗药物抗性和肿瘤复发等。

2.3结肠癌中m i R-132表达降低的预后价值

Kapl an-M ei er生存曲线分析表明，低表达m i R-132的结肠癌患者与总生存期相关（见图3）。此外，多元回归分析表明m i R-132低表达（H R 23.74，95%CI：1.58，52.66，P=0.000）、TNM分期（H R 19.94，95%CI：1.27，42.85，P=0.000）和肿瘤组织分级（H R 16.23，95%CI：1.05，39.28，P=0.008）与总生存期相关（见表2）。多元COX回归分析进一步校正其他预后因素，结果表明m i R-132是影响结肠癌患者的预后因子（见表3）。

图1　m i R-132在结肠癌和正常结肠组织中的表达差异

图2　原位杂交检测m i R-132在结肠癌和正常结肠组织中的表达差异

表1　m i R-132表达与结肠癌临床特征的关系

图3　结肠癌患者中m i R-132表达的生存曲线

表3　多元回归分析结肠癌患者的预后因素

表2　结肠癌中m i R-132表达降低的预后价值

3　讨论

结肠癌早期症状不明显，且无特异性肿瘤标志物，大多数结肠癌患者诊断时已处于进展期，当结肠癌患者接受治疗后，复发和转移是影响患者预后的主要因素，由此导致结肠癌患者预后较差。最新研究结果显示，与正常神经元和胃组织相比，神经胶质瘤和胃癌组织中m i R-132表达上调［5-6］。此外，肺癌、膀胱癌、食管鳞癌、舌部鳞癌、子宫癌及睾丸癌等组织中亦有m i R-132表达下调，提示m i R-132作为肿瘤抑制基因发挥作用。人们试图探讨m i R-132在结肠癌患者预后中的价值，但到目前还没有发现有价值的结论。本研究结果表明，m i R-132在结肠癌中表达明显下降。此外，m i R-132表达降低还与结肠癌患者侵袭性临床病理特征和预后差密切相关。Li u等［5］在胃癌的研究中发现，m i R-132能够作为胃癌患者预后因子。79例胃癌患者中，m i R-132在癌组织中的表达水平明显高于相应的正常组织。Set t y等在神经胶质瘤的研究中发现，m i R-132在神经胶质瘤中表达更高，且m i R-132过表达与患者预后差相关［6］。这两项结果与本研究结果不一致，造成结果不一致的原因目前尚不清楚，可能是因肿瘤类型、标本量大小及所采取的研究方法不同引起的。本实验研究发现m i R-132表达在不同分期、分级结肠癌中存在明显的差异表达，提示其表达的下调可能是结肠癌进展过程中的重要步骤。国内学者杨秀芳等［7］研究m i R-132/212家族在肺癌中的作用，结果发现非小细胞肺癌中过表达m i R-132能够加快NSCLC细胞增殖，促进细胞侵袭和转移，表现出原癌基因的特征；而李书军等［8］发现m i R-132在食管鳞癌中的表达明显降低，与食管癌的临床分期以及预后相关，m i R-132表达水平可作为食管癌临床分期、分级和预后的潜在指标。上述研究结果亦支持本实验结果。根据以往研究结果m i R-132有可能发挥抑癌作用，也可能发挥促癌作用，具体发挥何种作用与肿瘤类型及肿瘤微环境有关。本研究结果表明，结肠癌组织中m i R-132呈低表达，且m i R-132低表达与分期更晚有关，提示m i R-132表达下调促进结肠癌的发展，因此笔者认为m i R-132在结肠癌中发挥抑癌作用。

近来m i RNA家族被证实为肿瘤的有效标志物，并且是肿瘤细胞上皮表型的决定性因素［9］。m i R-132已被证实在多种人类肿瘤中表达下调，被认为是肿瘤细胞迁移和侵袭过程中EM T的负向调控因子。m i R-132也被认为是增强结肠癌化疗敏感性或诱导肿瘤细胞死亡的新靶点［11］，而在一组卵巢腺癌细胞株内或获得性药物抗性研究中发现m i R-132表达与紫杉醇和顺铂化疗抗性有关。此外，还有多项研究发现结肠癌中m i R-132表达明显发生变化，但是这些研究结果多有相互冲突之处。部分研究属于m i RNA表达谱特征分析，由于分析时采用的芯片平台不一样，可能导致部分结果差异。相比之下，本研究采用 Real-t i m e RT-qPCR和原位杂交法分析m i R-132在结肠癌中的表达情况，实验结果显示，结肠癌组织中m i R-132表达明显下降，而在原位杂交中进一步分析结肠癌组织中m i R-132的表达情况，结果亦表明m i R-132在结肠癌中的表达低于正常结肠组织。提示m i R-132在结肠癌组织中低表达。本研究还发现，m i R-132低表达组与分期和分级相关，提示m i R-132表达抑制与结肠癌恶性程度更高密切相关。总之，本实验结果中m i R-132过表达抑制肿瘤进展，被认为是预测结肠癌患者生存的可靠生物标志物，m i R-132是进展期结肠癌患者潜在的有效治疗靶点。

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［11］Li u Q，Li ao F，W u H，et al.Upregul at i on of m i R-132 expressi on i n gl i om a and i t s cl i ni cal si gni f i cance［J］.Tum our Bi ol ogy t he Journal of t he Int ernat i onal Soci et y f or Oncodevel opm ent al Bi ol ogy&M edi ci ne，2014，13（4）:86-92.

（申海菊编辑）

Expression and roles of microRNA-132 in conlon carcinoma

Ji-ming Zhao，Jian Peng
（Xiangya Hospital，Central South University，Changsha，Hunan 410008，China）

Objective To investigate the association of miR-132 expression with clinicopathological characteristics and overall survival in patients with colon cancer.Methods Expression levels of the miR-132 were detected using qRT-PCR andin situhybridization.Associations of miR-132 expression with clinicopathological factors and overall survival were statistically evaluated.Results The expression levels of miR-132 in the colon cancer tissues were significantly lower than those in the normal colon tissues，in line with the findings ofin situhybridization（P＜0.01）.In addition，the tumors with low miR-132 expression were more likely to have advanced clinical stage（bothP=0.006）and higher grade（P=0.01 and 0.02）.Moreover，univariate analysis showed that the colon cancer patients with low miR-132 expression had shorter overall survival（P＜0.01）. Multivariate statistical analysis further identified miR-132 as an independent prognostic factor for colon cancer （P＜0.01）.Conclusions miR-132 low-expression may promote the aggressive tumor progression and be recognized as a reliable marker to predict the survival in patients with colon cancer.The three miRNAs could be attractive therapeutic targets in patients with advanced-stage colon cancer.

colon cancer；clinicopathology；miR-132；prognosis

R 735.35

A

1005-8982（2016）05-0048-05

10.3969/j.i s sn.1005-8982.2016.05.010

2015-08-28

彭健，Tel：13607441906，E-m ai l：158924615@qq.com