肝X受体激动剂上调人肾小球内皮细胞血栓调节蛋白表达的机制和作用*

丁涵露，李怡，冯韵霖，陈瑾，钟翔，王楠，汪伟，张萍，王莉

［1.四川省医学科学院（四川省人民医院）肾内科，四川 成都 610072；2.四川省成都市第二人民医院肾内科，四川 成都 610017］

·论著·

肝X受体激动剂上调人肾小球内皮细胞血栓调节蛋白表达的机制和作用*

丁涵露1，李怡1，冯韵霖1，陈瑾1，钟翔1，王楠2，汪伟1，张萍1，王莉1

［1.四川省医学科学院（四川省人民医院）肾内科，四川 成都 610072；2.四川省成都市第二人民医院肾内科，四川 成都 610017］

目的探讨肝X受体（LX R）激动剂T0901317上调人肾小球内皮细胞（H R G EC）血栓调节蛋白（TM）表达的机制和作用。方法W es t ern bl ot检测25 m m ol高糖和2μm ol T0901317刺激后的H R G EC上IκBα、磷酸化IκBα、核转录因子-κB（N F-κB）p65、磷酸化N F-κB p65表达；免疫共沉淀法检测LX R与P300之间有无结合；重组腺病毒AdTM shR N A转染H R G EC，观察其对高糖下H R G EC分泌炎症介质的影响。结果T0901317能显著降低高糖刺激后的IκBα和N F-κB p65磷酸化（P＜0.05），LX R-α沉默后N F-κB活性增强；2μm ol T0901317刺激H R G EC 24 h后以C o-IP检测LX R与P300的表达上调；T0901317明显抑制高糖刺激下的H R G EC培养上清中TN F-α、IL-1β浓度（P＜0.05），AdTM s hR N A转染H R G EC后，有或无T0901317刺激，H R G EC培养上清中TN F-α、IL-1β浓度与高糖组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。结论LX R可能通过与P300发生相互作用阻断了N F-κB与P300之间的竞争性结合而提高TM的表达并抑制炎症介质的分泌。

人肾小球内皮细胞；肝X受体；血栓调节蛋白；核转录因子-κB

人肾小球内皮细胞（hum an renal gl om erul ar endot hel i al cel l s，H RGEC）炎性损伤是慢性肾脏病尿蛋白形成的重要原因，既往研究多集中于致炎机制，而对H RGEC内源性抗炎机制的关注很少。血栓调节蛋白（t hrom bom odul i n，TM）通过促进活化蛋白C形成及抑制高迁移率族蛋白1等途径发挥重要的内源性抗炎功能［1］。肝X受体（l i ver X recept or，LXR）是核受体家族成员中一种重要的核受体，T0901317是LXR的高亲和力人工合成配体，通常用于实验研究。在哺乳动物中存在LXRα和LXRβ两种亚型，LXR激动剂与LXR结合后激活靶基因的转录而参与胆固醇、脂类和葡萄糖等物质代谢［1-2］，以及发挥重要的抗炎作用［3-4］。前期的研究发现培养的H RGEC表达LXRα、LXRβ，LXR激动剂主要通过LXRα上调TM表达，但LXR激动剂上调H RGEC TM表达的机制不明，以荧光素酶报告实验发现TM启动子区域（-2494～+160）无LXR结合点。核转录因子-κB （nucl ear t ranscri pt i on f act or-κB，NF-κB）需要与协同转录辅活化因子P300结合才能发挥转录活性［5-6］，有人发现，核受体家族成员PPARγ依赖配体激活后，通过与NF-κB竞争结合P300而起到抑制核转录因子-κB信号通路活性的作用［7］，同样作为核受体家族的全反式维甲酸也是通过竞争性结合P300而抑制肿瘤坏死因子-α（t um or necrosi s f act or-α，TNF-α）诱导的TM表达下降［5，8］，因此笔者推测LXR可能通过竞争性结合P300而抑制NF-κB活性，故本研究拟检测高糖和LXR激动剂T0901317刺激后的H RGEC上NF-κB信号通路活性改变，在此基础上免疫共沉淀法检测LXR与P300之间有无结合，最后以重组腺病毒AdTM shRNA转染H RGEC，观察其对高糖刺激下H R GEC分泌炎症介质的影响，以探讨LXR激动剂上调TM表达的机制和作用。

1　材料与方法

1.1实验试剂

H RGEC和T0901317（美国Si gm a公司），小鼠抗人IκBα抗体、小鼠抗人磷酸化IκBα抗体、小鼠抗人NF-κB p65抗体，小鼠抗人磷酸化NF-κB p65抗体（美国Cel l Si gnal i ng Technol ogy公司）、兔抗人P300抗体、兔抗人TM抗体（美国Sant a公司），小鼠抗人β-act i n抗体、羊抗小鼠IgG、羊抗兔IgG（北京博奥森公司），shRNA-LXRα设计与合成由美国Invi t rogen Li f e Technol ogi es公司完成，白介素-1β（i nt erl euki n-1β，IL-1β）和TNF-α酶联免疫吸 附 法 （enzym e-l i nkedi m m unosorbent assay，ELISA）试剂盒（美国Pi erce公司）。

1.2W est ern bl ot检测LXR激动剂及shR N ALXR α对N F-kB信号通路蛋白的作用

1.2.1实验分组①二甲基亚砜（di m et hyl sul f oxi de，DM SO）对照组；②25 m m ol/L葡萄糖组（Gs组）；③25 m m ol/L葡萄糖+2μm ol/L T0901317（Gs+T09组）；④25 m m ol/L甘露醇组（M a组）；⑤shRNALXRα+25 m m ol/L葡萄糖+2μm ol/L T0901317；⑥shRNA-C ont rol+25m m ol/L葡 萄 糖+2μm ol/L T0901317，其中⑤⑥组分别给予含shRNA-LXRα或shRNA-Cont rol病毒液转染，24 h更换成完全培养基继续培养至48 h，将病毒感染48 h后的细胞分别予以葡萄糖和/或T0901317处理24 h。

1.2.2实验方法上述各实验分组在药物处理24 h后收集细胞加蛋白裂解液提取总蛋白，检测细胞总蛋白浓度后取50μg蛋白样品经十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺（sodi um dodecyl sul f at e-pol yacryl am i de gel el ect rophoresi s，SDS-PAGE）凝胶电泳后，13 V恒压过夜，将凝胶中蛋白质转移至聚偏二氟乙烯（pol yvi nyl i dene f l uori de，PVDF）膜上。PVDF膜以含5%脱脂奶粉的TBST室温封闭2 h，分别加入phosphor-NF-κB p65（1∶1 000）、NF-κB p65（1∶1000）、phosphor-IκBα（1∶1 000）、IκBα（1∶1 000）和β-act i n（1∶1 000）单克隆抗体室温反应2 h，山羊抗兔、山羊抗小鼠IgG二抗（1∶1 000）室温孵育2 h，化学发光显色，每组实验均重复3次，用Gel Pro Anal yzer 3.2图像分析软件分析条带灰度值，取平均值做为实验结果。

1.3免疫共沉淀法检测LXR与P300之间有无结合

分别将有或无2μm ol/L T0901317处理24 h的H RGEC做LXR与P300的免疫沉淀反应，用含1% Tri t on X-100磷酸盐缓冲溶液（phosphat e buf f er sal i ne，PBS）（含蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂）提取细胞匀浆，4℃、14000×g离心30m i n后，将裂解液分成4等份，一份加入10μl兔IgG抗体作为阴性对照组，一份不加抗体作为空白对照组，一份加入0.2μg P300抗体，一份加入0.2μg TM抗体，上述各组分别在4℃孵育过夜，然后与100μl蛋白A/G琼脂糖珠子摇床4℃孵育6 h，2 000 r/mi n离心2 m i n，去上清液，以1.5 m l预冷的PBS反复离心洗涤珠子5次，去上清液，以5×上样缓冲液20μl于100℃变性10 m i n，2 000 r/mi n离心5 m i n，收集上清液，置于-20℃冰箱保存，用于10%SDS-PAGE电泳。

1.4ELI SA观察腺病毒AdTM shR N A对高糖刺激下H R G EC分泌炎症介质的影响

将构建成功的TM小分子干扰RNA的腺病毒AdTM shRNA用于以下实验。

1.4.1实验分组①25 m m ol/L葡萄糖组（Gs组）；②25 m m ol/L葡萄糖+2μm ol/L T0901317（Gs+T09组）；③25 m m ol/L葡萄糖+AdTM shRNA+2μm ol/L T0901317（Gs+AdTM shRNA+T09组）；④25 m m ol/L葡萄糖+Adcont rol+2μm ol/L T0901317（Gs+AdCt rl+ T09组）；⑤25 m m ol/L葡萄糖+AdTM shRNA+（Gs+ AdTM shRNA组）；⑥25 m m ol/L葡萄糖+Adcont rol （Gs+AdCt rl组），其中③～⑥组分别给予含AdTM shRNA或Adcont rol病毒液转染，24 h更换成完全培养基继续培养至48 h，将病毒感染48 h后的细胞分别予以葡萄糖和/或T0901317处理24 h。

1.4.2实验方法上述各实验分组药物作用24 h后收集上清液，以ELISA检测细胞培养上清液中TNF-α、IL-1β浓度。

1.5统计学方法

采用SPSS 13.0统计软件进行数据分析，实验数据以均数±标准差（±s）表示，多组数据平均值比较用单因素方差分析（ANOVA），组间比较用Bonf erroni分析进行，两组间比较用t检验，所有检验均为双侧检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1W est ern bl ot检测LXR激动剂抑制N F-κB信号通路活性

Gs组与对照组的IκBα、NF-κB p65水平比较，经t检验，差异有统计学意义（tI κBα=-20.684，PI κBα= 0.000，tNF-κB p65=-13.133，PNF-κB p65=0.000），表明高糖刺激后，IκBα磷酸化增加和p-p65（核/浆）水平升高（见表1）。Gs+T09组与Gs组的p-IκBα、p-p65（核/浆）水平比较，经t检验，差异有统计学意义（tp-I κBα= -4.867，Pp-I κBα=0.008，tp-p65=-10.384，Pp-p65=0.000），Gs+T09组的p-IκBα、p-p65（核/浆）水平较Gs组降低，表明T0901317能降低高糖刺激后的p-IκBα、p-p65（核/浆）水平（见图1A、1B和表1）。shRNA-LXRα组与对照组的p-IκBα、p-p65（核/浆）水平比较，经t检验，差异有统计学意义（P＜0.05），shRNA-LXRa 组IκBα磷酸化增加，p-p65（核/浆）水平升高，表明shRNA-LXRα干扰后IκBα磷酸化增加，p-p65（核/浆）水平升高（见图1C、1D和表2）。

2.2免疫共沉淀法检测LXR与p300之间有结合

2μm ol T0901317刺激H RGEC 24 h后用Co-IP检测发现LXR与P300的表达上调，在以LXR抗体免疫共沉淀下来的蛋白复合物中可检测到P300蛋白，在以P300抗体免疫共沉淀下来的蛋白复合物中可检测到LXR蛋白（见图2）。由此可推断出T0901317可以促进LXR与P300之间的结合，证明LXR与P300之间是有相互作用的。由于NF-κB需要与P300结合才能发挥转录活性，因此结合本实验发现T0901317抑制NF-κB信号通路蛋白活性，笔者推测LXR可能竞争性与P300结合，阻断了NF-κB与P300之间的结合，NF-κB活性下降从而TM表达提高。

2.3AdTM shR N A转染H R G EC后抑制高糖下H R G EC分泌的炎症介质

Gs+T09组与高糖组的TNF-α、IL-1β水平比较，经t检验，差异有统计学意义（tTNF-α=15.728，PTNF-α= 0.000，tI L-1β=13.090，PI L-1β=0.000），Gs+T09组的TNF-α、IL-1β水平较高糖组降低，表明T0901317能降低高糖刺激后的 TNF-α、IL-1β 水平。Gs+AdTM shRNA+T09组的TNF-α、IL-1β水平与高糖组比较，经t检验，差异无统计学意义（tTNF-α= 1.880，PTNF-α=0.133，tI L-1β=1.654，PI L-1β=0.173）；Gs+ AdTM shRNA组的TNFα、IL-1β水平与高糖组比较，经t检验，差异无统计学意义（tTNF-α=2.76，PTNF-α= 0.051，tI L-1β=-0.533，PI L-1β=0.623）， 两 组 的TNF-α、IL-1β 水平较高糖组无明显降低，表明AdTM shRNA转染H RGEC后，无论有或无T0901317刺激，H RGEC培养上清中TNF-α、IL-1β水平都无明显降低，提示TM可能具有减轻高糖刺激下肾小球内皮细胞炎症反应的作用。见表3和图3。

表1　各组p-I kBα光密度和p-p65（核/浆）比较 （n=3，±s）

表1　各组p-I kBα光密度和p-p65（核/浆）比较 （n=3，±s）

组别P值对照组　6 0 . 6 7 ± 2 . 5 1 7 p -I k Bα光密度/ % F 值P 值p -p 6 5（核/浆）F 值8 5 . 6 7 ± 2 . 5 1 7 G s组　1 2 2 . 3 3 ± 4 . 5 0 9 　1 3 5 . 0 0 ± 6 . 0 0 0 G s + T 0 9组　7 0 . 6 7 ± 2 . 5 1 6 　1 1 4 . 0 0 ± 4 . 0 0 0 M a组　4 7 . 0 0 ± 4 . 0 0 0 　6 4 . 0 0 ± 4 . 0 0 0 2 6 5 . 1 8 8 　0 . 0 0 0 1 5 7 . 2 3 8 　0 . 0 0 0

图2　免疫共沉淀法检测LXR与P300之间有结合

表2　shR N A-LXR α干扰后各组p-I kBα光密度和p-p65（核/浆）比较 （%，n=3±s）

表2　shR N A-LXR α干扰后各组p-I kBα光密度和p-p65（核/浆）比较 （%，n=3±s）

组别p -p 6 5（核/浆）s h R N A -C t r l对照组　8 2 . 3 3 ± 3 . 5 1 1 　4 8 . 3 3 ± 2 . 5 1 6 s h R N A -L X Rα组　1 1 4 . 0 0 ± 6 . 0 0 0 　1 1 9 . 3 3 ± 4 . 0 4 1 t值　-7 . 8 8 9 　-2 5 . 8 3 0 P值　0 . 0 0 1 　0 . 0 0 0 p -I k Bα光密度/ %

表3　T0901317抑制高糖刺激下H R G EC分泌TN Fα、I L-1β （n=3，pg/m l，±s）

表3　T0901317抑制高糖刺激下H R G EC分泌TN Fα、I L-1β （n=3，pg/m l，±s）

组别P 值G s 　0 . 5 4 3 ± 0 . 3 2 5 T N F -α F 值P 值I L -1 β F 值1 7 9 . 5 3 ± 9 . 4 5 G s + T 0 9 　0 . 2 1 5 ± 0 . 1 5 7 　9 5 . 5 0 ± 5 . 8 5 G s + A d T M s h R N A + T 0 9 　0 . 4 9 4 ± 0 . 3 1 3 　1 6 7 . 6 7 ± 8 . 0 7 G s + A d C t r l + T 0 9 　0 . 2 7 5 ± 0 . 1 8 5 　1 0 1 . 9 0 ± 4 . 0 3 G s + A d T M s h R N A 　0 . 4 2 1 ± 0 . 2 5 5 　1 8 3 . 3 7 ± 8 . 1 3 G s + A d C t r l 　0 . 5 1 5 ± 0 . 1 6 3 　1 7 3 . 7 3 ± 8 . 3 1 9 3 . 9 2 1 　0 . 0 0 0 8 6 . 1 7 8 　0 . 0 0 0

图3　AdTM shR N A转染H R G EC抑制高糖下H R G EC分泌TN F-α、I L-1β

3　讨论

NF-κB是普遍存在于细胞浆中以p50/p65异二聚体为形式的一种快反应转录因子，与NF-κB的抑制性蛋白 IκB（i nhi bi t or，IκB）包括IκBα和IκBβ）结合而呈非活性状态。当细胞受到病原菌等刺激时，IκB激酶因磷酸化而活化并使IκBα发生磷酸化，继而发生泛素化而被26 S蛋白酶体降解。IκBα降解使得p50/p65转位入核，对多种靶基因发挥转录调控作用。p65的核定位信号区的N-氨基端（S276）发生磷酸化是p50/p65异二聚体转位、与靶基因DNA结合及调节靶基因转录所必需的［9-10］，已经明确，大多数的炎症介质包括TNF-α、IL-6启动子中包含特异性NF-κB结合保守序列［11-12］。

既往研究报道，NF-κB可通过竞争性结合P300而抑制某些转录因子的活化［13-14］，而且LXR启动子区域可能含有NF-κB的结合位点［15-16］。IκBα磷酸化是NF-κB通路得以激活的初始信号，本实验发现高糖刺激后IκBα磷酸化比例明显增加，LXR激动剂T0901317能显著降低高糖刺激后的IκBα磷酸化和NF-κB p65磷酸化。特异性敲低H RGEC上的LXRα，再以高糖刺激及T09013171处理，与无效RNA干扰对照组比较，IκBα磷酸化比例增加（P＜0.05），同样磷酸化NF-κB p65水平也显著提高（P＜0.01），提示T0901317可抑制NF-κB信号通路蛋白活性，而且这种抑制作用依赖于LXRα的活化，上述实验结果与已有文献报道的LXR激动剂抑制IκB磷酸化和NF-κB p65转位入核而上调缺血心肌细胞血红素加氧酶的表达相一致［16］，因此本实验中LXR激动剂促进TM表达有可能与其抑制NF-κB信号通路蛋白的活性有关。

作为核受体家族一员的 LXR活化后抑制NF-κB通路活性的机制虽然尚未完全阐明，但有人发现，核受体家族的另一个重要成员PPARγ能与NF-κB发生生理性相互作用，PPARγ激动剂存在时两者的相互作用增强，并抑制NF-κB驱动炎症因子基因转录［17］。而有人则提出，PPARγ依赖配体激活后，通过与NF-κB竞争结合P300而起到抑制NF-κB信号通路活性的作用［7］。同样作为核受体家族的全反式维甲酸也是通过竞争性结合P300而抑制TNF-α诱导的TM表达下降［5，8］，在本实验中，T0901317刺激后的H RGEC上NF-κB信号通路活性下降，加之免疫共沉淀法检测到LXR与P300之间有结合，因此推测LXR活化后，LXR可能通过与NF-κB竞争性结合P300而抑制NF-κB的活性，达到上调TM表达和抑制炎症介质分泌的作用。

LXR-β在多种组织广泛表达，LXR-α主要表达在胆固醇代谢组织［18］，之前的研究发现LXR-α、LXR-β表达在H RGEC，LXR-α激活后TM表达增强。本实验发现，转染LXR-α-si RNA后，H RGEC的NF-κB信号通路蛋白活性增加，提示LXR-α活化在H R GEC表达TM中可能起重要作用，鉴于T0901317可同时激活LXR-α、LXR-β［19］，因此内源性LXR-β在TM表达中的作用不能完全排除。总之，本实验发现LXR活化可抑制内皮细胞炎症介质分泌，因此靶向LXR-TM的治疗可能会减轻高糖下内皮细胞的炎症反应。

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（申海菊编辑）

Mechanism and role of LXR agonist upregulating thrombomodulin expression in human glomerular endothelial cells*

Han-lu Ding1，Yi Li1，Yun-lin Feng1，Jin Chen1，Xiang Zhong1，Nan Wang2，Wei Wang1，Ping Zhang1，Li Wang1
（1.Department of Nephrology，Sichuan Provincial People's Hospital，Chengdu，Sichuan 610072，China；2.Department of Nephrology，the Second People's Hospital of Chengdu，Chengdu，Sichuan 610017，China）

ObjectiveToexploretheeffectofliverXreceptor（LXR）agonistT0901317on thrombomodulin（TM）expression in human glomerular endothelial cells（HUGECs）and its mechanism. Methods Western blot was used to detect the expressions of IκBα，p-IκBα，nuclear transcription factor-κB （NF-κβ）p65 and p-NF-κB p65 in HUGECs stimulated by 25 mmol high glucose and 2 μmol T0901317.The interaction between LXR and the transcriptional coactivator p300 in HUGECs was detected using coimmunoprecipitation（Co-IP）assay.The concentrations of IL-1β and TNF-α in the supernatant of HUGECs transfected with or without AdTMshRNA were determined using commercially available ELISA kits.Results T0901317（2 μmol）significantly reduced the phosphorylation of IκBα and NF-κB p65 in the HUGECs stimulated by high glucose（P＜0.05）.The activity of NF-κB was increased by LXR-α silencing despite thepresence of T0901317.Co-IP revealed up-regulation of LXP and p300 in the HUGECs 24 h after stimulation by 2 μmol T0901317.T0901317 inhibited the secretion of high glucose-induced inflammatory cytokines such as TNF-α and IL-1β in the HUGECs（P＜0.05）.The levels of TNF-α and IL-1β were increased by TM silencing with AdTMshRNA despite the presence of T0901317，but the differences were not significant（P＞0.05）.Conclusions LXR agonist increases TM expression and inhibits secretion of inflammatory mediators probably by competitively blocking the interaction between NF-κB and p300 through interaction with p300.

glomerular endothelial cell；liver X receptor；thrombomodulin；nuclear transcription factor-κB

R 692.9；TQ 937

A

1005-8982（2016）05-0001-06

10.3969/j.i s s n.1005-8982.2016.05.001

2015-06-01
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国家自然科学基金（No：81170680）；四川省科技厅课题（No：2013JY0141）

王莉，E-m ai l：scwangl i 62@163.com