香菜挥发油体外抑制Saos-2细胞生长与迁移*

赖家玲，付文垚，何欣，肖川云，曹俊

（江西省九江学院 1.临床医学院，2.药学与生命科学学院，3.基础医学院，江西 九江 332000）

香菜挥发油体外抑制Saos-2细胞生长与迁移*

赖家玲1，付文垚2，何欣2，肖川云2，曹俊3

（江西省九江学院 1.临床医学院，2.药学与生命科学学院，3.基础医学院，江西 九江 332000）

目的探讨香菜挥发油对Saos-2肿瘤细胞株体外生长及迁移的影响。方法采用超声波辅助醇提法制备香菜挥发油；M TT法检测香菜挥发油对Saos-2细胞生长抑制作用；Trans w el l趋化小室检测细胞迁移抑制作用；定量PC R检测细胞内P21C i p1/W af1、P27Ki p1、N M23H1和S100A4的表达变化。结果使用超声辅助醇提法，香菜挥发油得率为0.424%；香菜挥发油可明显抑制Saos-2细胞的生长与迁移，伴随细胞内P21 C i p1/W af1及P27Ki p1的升高及S100A4降低，显示具有较强的抗成骨肉瘤活性。结论香菜挥发油可体外抑制Saos-2细胞生长及迁移，其可能机制与P21C i p1/W af1、P27Ki p1及S100A4有关。

香菜挥发油；抗肿瘤；P21C i p1/W af1；P27Ki p1；S100A4

香菜又名芫荽、胡荽、香荽等，属伞形科芫荽属。香菜营养丰富，并有强烈气味，其茎叶常作为日常蔬菜和调香料。研究显示香菜还具有多种药理作用，其主要药理成分包括挥发油及黄酮等，已知香菜挥发油具有抗菌、抗氧化、抗肿瘤和促毛发生长等多种活性［1-4］。本研究采用超声波辅助醇溶剂法制备香菜挥发油，探讨其对人成骨肉瘤细胞株Saos-2的生长及迁移的作用，同时检测胞内抑癌基因P21Ci p1/W af1、P27Ki p1及肿瘤迁移相关基因NM23H1和S100A4含量的变化，从分子水平明确香菜挥发油抑制细胞生长及迁移的机制。

1　材料与方法

1.1材料

香菜（购自九江市超市），Saos-2细胞株（来自江西省系统生物医学重点实验室），槲皮素（购自美国 Si gm a公司），FBS（购自 H ycl one公司），RPM I 1640培养基（购自吉诺生物医药技术有限公司），Transwel l cam ber（购于 Corni ng公司），噻唑蓝（m et hyl t hi azol yl t et razol i um，M TT）（Am resco公司，由北京索莱宝分装），GoScri pt Reverse Transcri pt i on Syst em（购自Prom ega公司），Tri zol（购自Invi t rogen公司），SYBR Prem i x Ex TaqⅡ（Tl i RNaseH Pl us）（购自TaKaRa公司）。

1.2仪器与设备

超声波清洗机（南昌市化学仪器有限公司），旋转蒸发仪（巩义市宇翔仪器有限公司），粉碎机（上海市亚荣生化仪器厂），重光IBE2000型倒置荧光显微镜（中国重庆光电仪器有限公司），5420-1型二氧化碳CO2培养箱（日本Napco公司），Bi o-Rad 550型酶标仪（美国伯乐公司），ABI7500型荧光定量PCR仪（美国ABI公司），NanoDrop2000超微量分光光度计（美国赛默飞世尔公司）。

1.3方法

1.3.1香菜挥发油的制备香菜茎叶经太阳照射6 h除去表面的水分，放入恒温干燥箱中干燥24 h，粉碎后超低温条件下保存。取粉末50 g放入500 m l的烧杯并加入200 m l无水乙醇。搅拌至粉末充分浸润，并盖上保鲜膜。70℃超声波提取3次，每次20 m i n，超声工作频率为99 H z。加入无水硫酸钠干燥，制得0.212 g挥发油固体。加入无水乙醇使挥发油溶解，配制成浓度为1.0、0.8、0.6及0.4 m g/m l的香菜挥发油母液，取上述母液分别加入RPM I 1640培养基，配成浓度为5、4、3及2μg/m l的细胞培养液，各组培养液中乙醇的终浓度均为0.5%。

1.3.2细胞培养及M TT细胞培养人成骨肉瘤细胞株Saos-2采用RPM I 1640培养基（含10%FBS、1%双抗）培养，置于37℃、5%CO2培养箱中，每隔72 h换液1次。M TT：于96孔板内培养细胞，每孔接种1万个，贴壁后分别加入4种含不同浓度的香菜挥发油（5、4、3及 2μg/m l）培养基培养，每孔200μl，空白对照组为含0.5%乙醇培养基，阳性对照组采用400μg/m l槲皮素。培养72 h后于重光IBE2000型倒置荧光显微镜拍照记录，弃去上清，每孔加入M TT试剂150μl，4 h后弃去上清再加入DM SO 200μl进行溶解，置于Bi o-Rad 550型酶标仪，测其OD值，计算出细胞生长活性度。细胞生长活性度=［1-（对照组平均OD值-实验组平均OD值）/对照组平均OD值］×100%。

1.3.3细胞迁移抑制检测①Saos-2细胞消化后用含0.1%FBS培养基重悬，并调整细胞密度至1× 105，培养基中分别含终浓度5μg/m l的香菜挥发油及0.5%的乙醇。②取细胞悬液200μl加入t ranswel l cam ber趋化小室上室，下室中加入600μl含10%FBS的培养基，培养24 h。③将上室从24孔板中取出，用棉签擦去上室内的细胞，然后放入0.1%结晶紫中染色20 m i n，再用三蒸水冲洗3遍，在光镜下观察穿膜细胞数。采用10×物镜，每个小室取6个视野，计算各视野细胞数目，拍照并保存。细胞迁移抑制率=［（对照组迁移细胞数－香菜挥发油组迁移细胞数）/对照组迁移细胞数］×100%。

1.3.4荧光定量PC R5μg/ml的香菜挥发油处理Saos-2细胞72 h，以0.5%的乙醇作为对照，Tri zol法提取细胞总RNA，Nanodrop 2000测定纯度，采用GoScri ptReverse Transcri pt i on Syst em（Prom ega）进行逆转录，操作按试剂盒说明书进行；定量PCR扩增采用SYBR Prem i x Ex TaqⅡ（Tl i RNaseH Pl us），在ABI7500型荧光定量PCR仪上检测，PCR程序为95℃预变性30 s，95℃ 5 s，60℃ 34 s，共40循环。以ACTB作为内参，目的基因表达水平采用2-△△CT法进行分析，所有基因检测均重复3次（见表1）。

表1　实时PC R引物序列

1.4统计学方法

图1　香菜挥发油抑制Saos-2的生长 （×40）

图2　香菜挥发油体外抑制Saos-2的迁移 （×100）

2　结果

2.1香菜挥发油得率

用电子分析天平精密称量香菜挥发油质量为0.212 g，而总的质量为50 g，计算挥发油的得率为0.424%。

2.2M TT结果

各组细胞活性与药物剂量成反比，提示抑制作用呈剂量依赖性（见表2），香菜挥发油具有明显抑制Saos-2细胞生长的作用（见图1）。

2.3迁移抑制结果

在香菜挥发油5μg/m l组，对Saos-2细胞t ranswel l趋化小室的上室底膜反面10倍物镜下6个视野细胞计数分别为2、4、3、4、0及1个，均数为2.333，下室中未见有细胞悬浮或贴壁；在乙醇对照组，显示上室底膜反面有较多细胞黏附，在10倍物镜下取6个视野计数为14、13、12、15、10及17，均数为13.500。根据公式计算，香菜挥发油对Saos-2细胞的迁移抑制率=［（对照组迁移细胞数－香菜挥发油组迁移细胞数）/对照组迁移细胞数］×100%=［（13.5-2.33）/13.5］×100%=82.716%。结果提示香菜挥发油可显著抑制体外Saos-2细胞的迁移（见图2）。定量PCR结果见图3。

表2　各组M TT实验结果

图3　定量PC R检测结果

3　讨论

植物挥发油为中药的重要有效成分，分布广泛，含量一般在1%以下。目前常用的挥发油提取方法有蒸馏法、溶剂提取法、压榨法、超声波辅助萃取法、微波辅助萃取法、超临界流体萃取法和酶解提取法等［5］。其中超声波辅助萃取法利用超声波产生的强烈振动和空化效应，加速药物有效成分进入溶剂，从而提高提取效率，缩短提取时间，同时还可以防止高温对提取成分的破坏［6-7］。本研究中利用该方法香菜挥发油的得率达到0.424%，可见是一种比较好的制备方法。

目前，各种植物挥发油类成分对肿瘤的作用已有报道，如花椒挥发油、姜黄挥发油、洋葱挥发油及荆芥挥发油等均有抗肿瘤作用［8-11］。研究提示香菜挥发油类可阻断亚硝酸盐的合成［12］，香菜甲醇提取物对M K-1、H eLa和B16F10等多种肿瘤细胞系有生长抑制作用［13］。本研究发现香菜挥发油可明显抑制人骨肉瘤细胞Saos-2的生长，5μg/m l浓度时细胞活性度为34.519%，这种抑制作用呈剂量依赖。同时，5μg/m l浓度对细胞的迁移抑制率达到82.716%。

P21Ci p1/W af1可与 cycl i n/CDK结合而抑制CDK的活性，P21Ci p1/W af1不但阻滞细胞G1/S转换，而且也参与G2/M转换的调节［14］。P27Ki p1与P21Ci p1/W af1有一定的同源性，亦具有阻止细胞通过G1/S期转换的“关卡”作用，从而抑制细胞增殖［15］。研究还显示，P21Ci p1/W af1与P27Ki p1在肿瘤内表达水平的高低与肿瘤的恶性程度密切相关，在高分化肿瘤这两种抑癌基因的表达水平比低分化肿瘤高［16］。本研究中笔者发现香菜挥发油可明显上调Saos-2细胞中P21Ci p1/W af1及P27Ki p1的表达，说明其对细胞的生长抑制作用与这两种抑癌基因的高表达有关。S100A4基因属于S-100钙离子结合蛋白超家族，被认为与肿瘤细胞的转移与扩散密切相关［17］。研究显示S100A4可以减少骨肉瘤细胞间的黏附、促进骨肉瘤细胞外基质的降解和重塑，增加骨肉瘤细胞的运动，几乎参与了骨肉瘤的发生、发展、侵袭及转移的整个过程［18］，同时S100A4还是成骨细胞分化及矿化的负性调控因子［19］。本研究发现香菜挥发油可显著抑制S100A4的表达，而另一种主要的迁移促进基因NM23H1表达无明显变化，提示香菜挥发油对迁移的抑制主要与S100A4的表达下调相关，由于S100A4是成骨分化的抑制基因，其表达下调可能同时促进了细胞的成骨分化成熟，在后续研究中将进一步关注。

综上所述，本研究首次证实香菜挥发油对人成骨肉瘤细胞株Saos-2的生长及迁移有显著抑制作用，并初步探讨了其分子机制，为香菜的进一步开发利用奠定了基础。

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（王荣兵编辑）

Coriander volatile oil inhibits growth and migration of Saos-2 cellsin vitro*

Jia-ling Lai1，Wen-yao Fu2，Xing He2，Chuan-yun Xiao2，Jun Cao3
（1.Clinical Medical College；2.College of Pharmacy and Life Sciences；3.College of Basic Medical Sciences，Jiujiang University，Jiujiang，Jiangxi 332000，China）

Objective To extract coriander volatile oil and investigate its effects on growth and migration of human Saos-2 cellsin vitro.Methods Ultrasound-assisted ethanol extraction was used to prepare coriander volatile oil.MTT assay was used to determine the growth inhibion of Saos-2 cells by volatile oil.Cell migration was examined using Boyden chamber assay.Expression ofP21Cip1/Waf1，P27Kip1，NM23H1 and S100A4 were examined by real-time PCR.Results The results showed that the yield of coriander volatile oil was 0.424%using ultrasound-assisted ethanol extraction.Coriander volatile oil inhibited the growth and migration of Saos-2 cells，along with the decrease in the expression levels ofP21Cip1/Waf1，P27Kip1 and S100A4.Conclusions Coriander volatile oil can inhibit Saos-2 cell growth and migration in vitro，which may involveP21Cip1/Waf1，P27Kip1 andS100A4.

coriander volatile oil；anti-tumour；P21Cip1/Waf1；P27Kip1；S100A4

R 282.71

A

1005-8982（2016）05-0017-05

10.3969/j.i s s n.1005-8982.2016.05.004

2015-07-27
*

江西省卫生厅科技计划项目（No：20157101）；江西省教育厅科学技术研究项目（赣教技字GJJ08441）

曹俊，E-m ai l：caoj un002@al i yun.com