益生菌制剂对钙缺乏骨质疏松症的防治作用

张颜廷 Joerg J.Jacoby,2 王静* 刘虹 张化朋 王丽春

1.山东凤凰生物有限公司，泰安 271000； 2.山东宝来利来生物工程股份有限公司，泰安 271000

骨质疏松症是一种以低骨量和骨组织微细结构破坏为特征，导致骨的脆性和骨折危险性增加的疾病，主要是以为骨骼代谢失衡，骨的再吸收作用大于骨的形成作用[1]。骨质疏松症是一种多因素引起的慢性疾病，随着年龄的增长骨质流失而导致骨质疏松症，这种持续的骨质流失会使骨的吸收与再生越来越慢，骨折的发生率随之增加[2]。50岁以上的中老年人、绝经后妇女、营养不均衡人群容易患骨质疏松症。目前对于骨质疏松的治疗药物一般主要有钙制剂、维生素D和钙的复合制剂和抗骨吸收药及激素等药物，但是由于药物及激素的长期服用，其副作用也逐渐突显。最近研究发现，维生素K2具有促进骨形成，防治骨质疏松症的作用[3,4]。自1995年日本首次批准维生素K2作为骨质疏松治疗用药以来, 其疗效及药用安全性得到了广泛而深入的研究和认可，但是由于由于其从发酵的纳豆中提取，来源有限且价格昂贵，并未普及[5]，且目前关于含维生素K2的益生菌制剂治疗骨质疏松的研究报道较少。本研究以钙摄入不足引起骨质疏松的大鼠为试验对象，利用自主研发的高产维生素K2(MK-7)的益生菌粉，配伍VD2及Ga等成分，探讨益生菌制剂对骨质疏松的作用。

1 材料和方法

1.1 药品与试剂

戊巴比妥钠，Merck P11011；大鼠羧化不全骨钙素(ucOC)检测试剂盒，上海酶联生物研究所；大鼠羧化骨钙素(cOC)检测试剂盒，上海酶联生物研究所；钙，郑州瑞普生物工程有限公司；维生素D，广州利源食品添加剂有限公司；低钙饲料购于北京科奥协力饲料有限公司；维生素K2(MK-7)益生菌粉为山东宝来利来公司生产。

1.2 仪器

美国好乐杰(Hologic)双能X线骨密度仪

1.3 试验动物与分组

清洁级雌性SD大鼠32只，体重220 g～250 g，随机分为4组，每组8只。分笼饲养，室温20～25℃，相对湿度40%～60%，自由饮水。将大鼠分为普通饲料饲喂组(对照组)、低钙饲料饲喂组(模型组)、低剂量复配产品治疗组(C1组)、高剂量复配产品治疗组(C2组)，C1组和C2组产品成分包括维生素K2(MK-7)的益生菌粉、VD2及Ga等。

对照组在实验过程中饲喂普通饲料，自由饮水。模型组、C1组、C2组同时饲喂低钙饲料。饲喂低钙饲料三周后，C1组、C2组给予产品治疗，C1组给予低剂量维生素K2(MK7)的益生菌粉(MK7剂量8.31ug/d.bw)+VD2(1.6ug/d.bw)+钙(80 mg/d)，C2组给予高剂量维生素K2(MK-7)的益生菌粉(MK-7剂量83.1ug/d.bw)+VD2(16ug/d.bw)+钙(80 mg/d)。通过灌胃的形式给药，给药时间为3周。每周称体重一次，根据体重调整灌胃量。

1.4 试验方法

实验开始前及实验结束后，用30 mg/mL戊巴比妥钠25 mg/kg腹腔注射麻醉大鼠，用双能X射线测定仪(DEXA)测定大鼠骨密度(BMD)及骨矿含量(BMC)，并计算△BMC和△BMD，△BMC为试验结束后大鼠的BMC值与试验开始时大鼠的BMC值的差值，△BMD为试验结束后大鼠的BMC值与试验开始时大鼠的BMC值的差值。实验结束后，完成DEXA测定时，对大鼠心脏取血，测定大鼠血清中羧化不完全骨钙素(ucOC)及羧化完全骨钙素(cOC)含量，计算ucOC/cOC值。

1.5 相关指标检测

美国好乐杰(Hologic)双能X线骨密度仪测定大鼠骨组织参数：BMC：骨矿物质含量，BMD：骨密度。

ELISA法测定ucOC及cOC水平：使用大鼠羧化不全骨钙素(ucOC)检测试剂盒测定血清中ucOC水平，使用大鼠羧化完全骨钙素(cOC)检测试剂盒测定血清中cOC水平。

1.6 数据分析

2 结果与分析

2.1 大鼠体重变化

在实验三周后，对照组、模型组、C1组、C2组大鼠的体重较试验开始时显著增加(P<0.05)，在试验后3周，灌胃产品的C1组、C2组大鼠的体重与对照组的大鼠的体重呈增加的趋势，而模型组大鼠体重无明显变化(P>0.05)。

图1 大鼠体重变化Fig.1 The change of weight in rats

2.2 骨矿含量测定结果

在饲喂6周后，与对照组相比，模型组、C1组、C2组的BMC值显著降低(P<0.05)。实验前后各组大鼠BMC值都有一定程度的增加，C1组与C2组增加量要显著高于模型组，差异有统计学意义(P<0.05)。

2.3 骨密度测定结果

与对照组相比，模型组、C1组、C2组大鼠的BMD显著降低(P<0.05)，在饲喂低钙饲料6周后，模型组大鼠骨密度要显著低于对照组(P<0.01)，并且要比饲喂之前低。后期灌胃产品的C1组、C2组大鼠骨密度要显著高于模型组(P<0.05)，且骨密度有一定的增加，增加量相对于模型组显著，具有统计学意义(P<0.05)(表1)。

表1 各组大鼠骨密度值变化Table 1 The change of BMD in rats of each group

注：对照组：正常饲喂组；模型组：饲喂低钙饲料组；C1组：低剂量产品灌胃组；C2组：高剂量产品灌胃组；与对照组比较，*P<0.05；与模型组比较，#P<0.05
Note: Control group-Normal feeding; Model group-Low calcium group;C1-Low dose probiotics group; C2-High dose probiotics group;*P<0.05 vs Control group;#P<0.05 vs Model group

2.4 ucOC/cOC值

给予产品三周后，与对照组相比，模型组、C1组、C2组大鼠的ucOC/cOC值差异不显著(P>0.05)。而C1组、C2组大鼠的ucOC/cOC值显著低于模型组，具有统计学意义(P<0.05)(表2)。

表2 各组大鼠ucOC/cOC值Table 2 The result of ucOC/cOC in rats of each group

注：对照组：正常饲喂组；模型组：饲喂低钙饲料组；C1组：低剂量产品灌胃组；C2组：高剂量产品灌胃组；与对照组比较，*P<0.05；与模型组比较，#P<0.05
Note: Control group-Normal feeding; Model group-Low calcium group;C1-Low dose probiotics group; C2-High dose probiotics group;*P<0.05 vs Control group;#P<0.05 vs Model group

3 讨论

研究表明，长期的低钙饮食使人体钙吸收减少，能够导致骨质疏松症[6,7]。有研究显示，成年动物钙摄入量少时，会导致骨松动，最终形成骨质疏松[8]。本研究发现，连续饲喂低钙饲料6周时，大鼠的骨矿含量及骨密度要显著低于正常饲喂组，即长期的钙缺失能够导致大鼠骨质疏松。

众所周知摄入充足的钙可以保证骨骼的健康成长并可以预防骨质流失。研究表明维生素D能促进钙被人体有效的吸收，将“肠钙”转化为“血钙”[9]。但是，该补充也有两面性，当钙摄入量过多，MGP浓度较低时，钙不能被人体有效利用，会出现血管等的钙化，引发一系列的心血管疾病[10]。研究表明，维生素K，特别是维生素K2(MK-7)能维持机体内钙的平衡，将“血钙”转化为“骨钙”[9]。2004年Liman Sun等人研究也表明活性VD3和VK2可以抑制蛋白质缺乏导致的骨质疏松[11]。陈鹏等的研究也发现维生素K2配伍维生素D3和柠檬酸钙具有明显增加骨密度和骨钙的作用[12]。本研究结果也发现灌胃产品组BMC与BMD值显著高于模型对照组，说明当维生素K2、维生素D以及钙同时存在时，具有提高骨矿含量，增强骨密度的作用，即含天然维生素K2的益生菌制剂能够有效地防治钙摄入不足引发的骨质疏松。

OC是血清骨钙蛋白，是骨形成和骨转换的标志，具有维生素K依赖性，可形成羧化完全骨钙素(cOC)，cOC能够转运血液中的钙到骨骼中，具有维持骨矿化速率、抑制软骨矿化速率等的作用。当维生素K不足时，OC不能完全羧化，形成羧化不完全骨钙素(ucOC)。研究表明，椎骨骨折的病人体内ucOC水平明显高于非骨折病人，当ucOC/cOC比率升高时，即说明了维生素K的缺乏同时也说明骨骼具有骨质疏松的风险[13]。最近研究发现，维生素K2是必不可少的骨代谢调节剂，能刺激成骨细胞的作用，促进骨形成[14,15]。Je SH等[16]研究显示联合应用维生素K2、维生素D和钙可减少ucOC的血液浓度。Hirao M[17]等研究显示维生素K2可促进骨钙素的羧化，形成cOC，增加股骨和颈骨密度。本试验结果表明，与模型组相比，灌胃复配产品组ucOC/cOC值显著降低，说明灌胃产品中补充的维生素K2能有效的被大鼠吸收，促进骨钙素的羧化，进而促进钙的有效利用，提高骨矿含量，降低其骨质疏松的风险。

本试验研究表明含有维生素K2的益生菌粉与维生素D和钙复配之后，能够有效的被大鼠吸收利用，达到防治骨质疏松的目的。