探究短期去势法对12月龄雌性大鼠骨质的影响

李永贤 张顺聪 粱德 杨志东 郭丹青 莫国业 李大星 冯蓬勃 唐永超 莫凌

1.广州中医药大学，广州 510405 2.广州中医药大学第一附属医院，广州 510407

骨质疏松症是一种中老年人常见的、多发的全身性骨代谢性疾病[1，2]。骨质疏松性椎体压缩骨折作为其最常见的并发症之一，严重影响中老年人的生存质量及生活水平。因此，通过动物实验对骨质疏松症进行研究具有重要的意义。从目前国内外报道来看，主要以研究原发性骨质疏松为主。造模方法主要有三种，去势法(摘除卵巢或睾丸)，维甲酸诱导法和糖皮质激素诱导法[3]。而以摘除双侧卵巢法制造骨质疏松动物模型较为常见，但是对于选择实验动物大鼠的鼠龄、以及造模时间仍然存在较大的争议。本文通过使用切除卵巢法作用于12月龄雌性大鼠，并饲养观察时间为1个月，最后通过检测其骨密度以及了解骨小梁情况，以探讨切除双侧卵巢法一个月对12月龄雌性大鼠骨质的影响。

1 材料和方法

1.1 实验动物处理

12月龄雌性SD大鼠，SPF级，400±20 g，由广州中医药大学动物实验中心提供，动物合格证编号：NO.44005800001890。动物饲养于广州中医药大学动物实验中心室内(SYXK(粤)2013—0034)。大鼠维持饲料购于广州中医药大学动物实验中心，并预先经辐照消毒处理。饲养于SPF级实验室的大鼠分为实验组与假手术组，各3只12月龄雌性SD大鼠，并进行称重与编号。

1.2 方法

1.2.1制造动物模型：实验组操作方法：配制10%水合氯醛溶液，按4 ml/kg剂量腹腔注射麻醉；摘除双侧卵巢，术后连续3 d预防性使用青霉素抗感染[im，20万U/(只·d)]。

假手术组实验操作方法：用相同的方法麻醉、固定、消毒后，切除与卵巢重量相同的皮下脂肪组织术后连续3d预防性使用青霉素抗感染(im，20万U/(只·d)。

1.2.2取骨与骨密度测量：造模一个月后，将各组大鼠用10%水合氯醛溶液腹腔注射麻醉，随后从腹部切口，取出全部椎体骨，切下第三椎体用于骨密度的检查，其余椎体骨用甲醛溶液保存起来。然后取下双侧的股骨和胫骨，左侧股骨用于骨密度检查，其余用甲醛溶液保存起来。

骨密度检查的设备为广州军区总医院骨科动物实验中心的Micro-CT，设备编号为EWK-149，规格型号为LCT200。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 大鼠BMD检测结果

对12月龄雌性大鼠使用切除卵巢法并饲养观察时间为一个月后实验组腰3椎体皮质骨BMD相对于假手术组有所下降，但无统计学意义(P>0.05)；而实验组腰3椎体松质骨BMD以及腰3椎体总体BMD却有所上升，无统计学意义(P>0.05)，见表1。实验组左侧股骨相对于假手术组其皮质骨BMD、松质骨BMD、总体BMD均有所下降，但经过统计分析，亦无统计学意义(P>0.05)，见表2。

组别n皮质骨BMD松质骨BMD总体BMD假手术组3904.53±60.12486.37±139.21604.97±129.92实验组3871.27±36.24551.47± 51.12657.33± 50.44

组别n皮质骨BMD松质骨BMD总体BMD假手术组31098.97±70.66551.20±36.38701.10±82.22实验组31057.23±21.99528.00±10.05666.47± 8.58

2.2 骨小梁相关情况

假手术组中12月龄雌性大鼠左侧股骨头端骨小梁情况，其骨小梁BMD为728.6 mg/cm3，骨小梁较为密集；实验组中12月龄雌性大鼠左侧股骨头端骨小梁情况，其骨小梁BMD为699.6 mg/cm3，提示实验组大鼠经过切除双侧卵巢1个月后骨小梁密度有所下降。从表3数据也可看出实验组的腰椎骨小梁、股骨骨小梁BMD与假手术组腰椎骨小梁、股骨骨小梁BMD相比，均有所下降，但无统计学意义(P>0.05)。

组别n腰椎骨小梁股骨骨小梁假手术组3630.50±65.82707.60±25.17实验组 3621.57±38.33701.13±14.96

3 讨论

骨质疏松时骨的脆性增加，骨量减少，骨的生物力学强度明显改变，应力强度降低。切除大鼠卵巢法制造绝经后的骨质疏松动物模型于1969年Saville建立[4]，为美国食品与药物管理局(FDA)和世界卫生组织(WHO)推荐的研究绝经后骨质疏松症的最佳模型[5]。其优点在于，造模因素单一、模型确定、重复性好。此外，摘除双侧卵巢后，体内雌激素缺乏，其对破骨细胞功能的抑制减弱，致破骨细胞的功能活跃，成骨细胞功能呈代偿性增强，但总体趋势为破骨作用大于成骨作用，造成骨量丢失，与妇女绝经后引起骨质疏松症有相似性[6]。但吴子祥[7]等人研究认为这种去势模型存在一定的局限性：卵巢切除模型能引起体内雌激素水平下降，但与临床实际不符，原发性骨质疏松症患者虽然卵巢功能低下，但其卵巢间质细胞在绝经后仍有一定的内分泌功能。此外，Peng[8]等人研究认为造模过程中，动物体质量因卵巢切除会有所增加，这对骨量减少有部分保护作用。

一般来说，大鼠寿命2.5-3.0年，1.7年左右才进入老年期，而大鼠6月龄以后，股骨骨密度的变化已极小，到12月龄时，各项骨参数均已达平台水平，人类的骨质疏松多发生在中年后期，故采用中老年大鼠可以复制出较为符合临床特征的动物模型[9]。目前，构建骨质疏松症动物模型时对造模持续时间尚无统一标准，国内多使用3～6月龄未孕雌性大鼠，研究持续时间多为2～3月[10]。唐存贵[11]等人研究发现3月龄和6月龄大鼠去卵巢6个月,均可发生骨质疏松症。郭峰[12]等人通过切除6月龄大鼠卵巢，研究发现建模后2至3个月去卵巢组骨矿密度显著低于假手术组(P<0.05)。不难发现对不同月龄的大鼠进行去势实验，其造模持续时间也不相同，所以关于造模持续时间仍然存在争议，这也是影响实验结果的重要因素之一。需要对不同月龄大鼠进行去势实验，并定期检测骨质疏松相关参数，才能确定合适的造模持续时间。当然这并不是唯一的影响因素，大鼠的喂养及饲养环境等因素也会影响造模持续时间。

文献中关于造模后测量骨密度所选择的部位的讨论不多，在动物研究中，Wang[13]等人建议用第四节腰椎和股骨颈作为研究部位。有研究认为手术后雌性大鼠在骨质疏松性骨折和骨量减少部位上也表现出与人类很大的相似性[14]。骨质疏松骨折常见部位是脊柱、髋部、桡骨远端和肱骨近端。目前国内外均以 DXA 骨密度仪检查的中轴骨骨密度值，即腰椎L1-L4，股骨颈，全髋 BMD 作为骨质疏松诊断的金标准。本研究选取了实验组与假手术组大鼠的第3腰椎和左侧股骨进行Micro-CT检测，以了解其骨密度、骨小梁相关情况。Micro-CT是一种分辨率更高的扫描技术，可以如实反映骨骼内部细微结构，得到较精确的结构参数。

本研究显示，实验组与假手术组对比，腰3椎体、左侧股骨以及骨小梁BMD有所下降，但均无统计学意义(P>0.05)。故对12月龄雌性大鼠切除双侧卵巢法并造模持续时间只为1个月难以制造出骨质疏松动物模型。通过切除雌性大鼠双侧卵巢法而制造骨质疏松动物模型虽然并不复杂,但选择适合月龄的大鼠、掌握好恰当的时间及对不同部位骨密度的测定对骨质疏松动物模型制作的成功极为重要,可最大限度的提高效率。有研究认为，手术作为一种创伤，引发应激反应，从而影响相关生化指标的测量，下一步的研究势必要检测相关生化指标，这将对探讨治疗骨质疏松的机理具有重要意义。