增龄对内皮祖细胞数量和功能活性的影响及与血管内皮功能的关系

夏文豪　张　斌　梁建文　苏　晨　张小宇　李　琰　陶　军

(中山大学附属第一医院高血压血管病科，广东　广州　510080)



增龄对内皮祖细胞数量和功能活性的影响及与血管内皮功能的关系

夏文豪张斌梁建文苏晨张小宇李琰陶军

(中山大学附属第一医院高血压血管病科，广东广州510080)

〔摘要〕目的探讨增龄对人外周血内皮祖细胞数量和功能活性的影响及与血管内皮功能的关系。方法入选32例健康老年人作为实验组(老年组)和30例健康青年人为对照组(青年组)。抽取受试者外周静脉血20 ml，采用密度梯度离心法分离提取内皮祖细胞，采用流式细胞技术比较两组志愿者循环中内皮祖细胞数量。体外培养7 d后，分别检测两组志愿者内皮祖细胞体外迁移及黏附能力；通过裸鼠颈动脉拉脱模型，比较内皮祖细胞在体内皮损伤修复能力。检测两组志愿者血流介导的血管舒张功能(FMD)。结果与青年组相比，老年组外周血中内皮祖细胞数量明显下降(P<0.01)，体外迁移、黏附(P<0.01)及在体再内皮化功能均明显受损。减少的在体再内皮化面积与下降的FMD之间呈正相关。结论增龄导致外周血中内皮祖细胞数量和功能活性受损与血管内皮功能下降密切相关，是动脉粥样硬化血管疾病发生发展的重要环节。

〔关键词〕增龄；内皮损伤；内皮功能；内皮祖细胞

增龄是最常见的心血管危险因子之一，其导致的血管内皮损伤是动脉粥样硬化血管疾病发生和发展的重要机制之一〔1,2〕。内皮祖细胞(EPCs)能定向分化为内皮细胞，修复血管内皮损伤，是血管内皮损伤修复最重要的机制之一〔3〕。然而，在心血管危险因素和疾病存在时，循环中EPCs的数量和功能逐渐下降，这种内源性血管内皮修复能力的减退是动脉粥样硬化血管疾病发生发展的重要原因〔4,5〕。当生理性衰老发生时，血管内皮依赖舒张功能受损，而且这种血管功能障碍与循环EPCs数量减少密切相关，提示循环EPCs数量减少导致的内源性血管修复能力下降是生理性衰老血管损伤的发病机制之一〔6〕。然而，增龄对EPCs数量和功能活性的影响及与血管内皮功能之间的关系有待进一步研究。本研究主要探讨增龄对EPCs数量和功能活性及血管内皮功能的影响。

1资料与方法

1.1研究对象分别招募32名老年志愿者〔年龄(68±6.6)岁〕和30名青年志愿者〔年龄(26±5.8)岁〕参与实验，分为老年组和青年组，两组志愿者均无心血管危险因素、心血管病史及临床证据。本研究方案得到我院伦理委员会批准，并与所有的研究对象签署知情同意书。基线特征均在正常范围，老年人与年轻人之间除年龄外其余特征差异无统计学意义(表1)。

表1　两组志愿者基线资料比较±s)

与青年组比较：1)P<0.01

1.2方法

1.2.1EPCs的分离和培养分别抽取两组志愿者外周静脉血30 ml，采用密度梯度离心法分离纯化出外周血单个核细胞，重悬于EGM-2培养基(含20%优质胎牛血清、青霉素100 U/ml、链霉素0.1 mg/ml、VEGF 50 ng/ml)，接种于预先包被好纤维连接蛋白(5 μg/cm2)的细胞培养瓶中，置于5% CO2，37℃培养箱中培养；3 d后移除未贴壁悬浮细胞，换培养液继续培养；每3 d换液，在倒置显微镜下动态观察细胞形态的变化，培养至7 d左右的贴壁细胞即为实验所用的EPCs〔7〕。

1.2.2EPCs的流式细胞计数培养7 d后，将贴壁细胞消化后重悬，每1×106个分置于EP管中，分别加入PE标记的鼠抗人CD31、KDR和CD133抗体各10 μl，阴性对照管加入PE标记的同型大鼠IgG抗体10 μl，4℃避光孵育30 min，250 r/min离心5 min，弃上清液，流式细胞检测缓冲液洗涤2次，4%多聚甲醛溶液重悬，流式细胞仪检测CD34+/KDR+及KDR+/CD133+阳性细胞数量。采用国际上公认CD34+/KDR+或KDR+/CD133+双阳性定义为循环内皮祖细胞。

1.2.3EPCs的体外迁移实验培养7 d之后，将EPCs消化后重悬，将2×104个EPCs加入Boyden小室上室，置于24孔板中，在下室中加入500 μl的不含胎牛血清的EBM-2，然后加入100 ng/ml的SDF-1，将其置于5%CO2，37℃培养箱培养；24 h后取出Boyden小室，小心弃去上层液体，用棉签小心擦掉小室滤膜孔上表面上未迁移的细胞；将Boyden小室置于4%多聚甲醛溶液中，固定10 min；荧光显微镜下观察，选择3个不同视野计数。

1.2.4EPCs的体外黏附实验将培养的HUVECs消化、重悬，按3×105/孔接种到六孔板中，于37℃、5%CO2培养箱中培养；培养48 h后形成内皮细胞单层后，加入1 μg/ml CM-DiI染料的无血清EGM-2培养液37℃、5%CO2培养箱中培养；孵育10 min后，消化重悬；将消化重悬的内皮祖细胞按1×105/孔加入上述准备好的内皮细胞单层中，37℃、5%CO2培养箱中培养。3 h后弃去培养基，用4%多聚甲醛溶液固定细胞10 min，DAPI溶液染色10 min，荧光显微镜下观察，计算黏附于内皮细胞单层上的EPCs数量。

1.2.5裸鼠颈动脉拉脱损伤模型(1)手术：取8～10周龄的裸鼠，腹腔注射水合氯醛进行麻醉，颈部正中切口游离、暴露颈外动脉后，在其下穿2根5-0丝线，距离大约0.5 cm，结扎远端(靠近头部端)。在2根丝线间颈外动脉上剪开一小口，插入直径0.35 mm的金属导丝至颈总动脉，旋转进出3次，结扎颈外动脉近端。(2)EPCs移植：将培养7 d的EPCs消化，PBS缓冲液重悬为密度5×105/100 μl的细胞悬液置于37℃(EPCs示踪实验时EPCs先用CM-DiI标记)，拉脱手术约3 h后裸鼠苏醒，将上述EPCs悬液按5×105/只从尾静脉注入裸鼠体内，对照组用不含细胞的PBS缓冲液或HUVEs注射。(3)伊文思蓝染色：将手术3 d后的裸鼠麻醉，经尾静脉注入100 μl的5%伊文思蓝溶液，10 min后打开颈部正中切口分离取出双侧颈总动脉，处死动物； 将动脉条置于PBS缓冲液中漂洗干净后纵切开，内膜朝上置于载玻片上拍照〔8〕。

1.2.6血流介导的血管舒张功能(FMD)检测采用日本UNEXEF高分辨率超声血管内皮分析仪分析肱动脉血流介导的内皮舒张功能。受试者在测试前4 h禁食，12 h内禁止吸烟、摄入酒精、咖啡因等，在一个安静、温度舒适的房间内休息至少10 min后进行FMD测量。用带有10 MHz的H型探头，记录基线时的右肱动脉纵向影像；然后在超收缩压紧压(右侧前臂，紧压5 min，超过收缩血压50 mmHg)、充气囊放气后2 min之内持续记录二维灰度图像和纵向平面中肱动脉的A-模型波。用心电图R波，使之与每博肱动脉收缩直径同步，自动跟踪并持续记录舒张直径的变化。用反应性充血期间最大扩张时的直径变化百分比(相比于基线值)估算FMD。

2结果

2.1外周血中EPCs数量与青年组〔(0.043±0.008)%、(0.04±0.01)%〕相比，老年组外周血单核细胞中CD34+/KDR+双阳性〔(0.027±0.006)%〕和KDR+/CD133+双阳性细胞比例〔(0.022±0.006)%〕均显著减低(P<0.01)。

2.2EPCs体外迁移实验结果相比于青年组〔SDF-1(-):39±6,(+):67±11〕，老年组EPCs基础迁移水平〔SDF-1(-):28±7〕降低(P<0.05)，SDF-1诱导的迁移能力减低〔SDF-1(+):46±9〕更为明显(P<0.001)。见图1。

2.3EPCs体外黏附实验结果TNF-α(-)：青年组41±6，老年组22±7;TNF-α(+):青年组77±11;老年组58±9。荧光显微镜计数黏附在内皮细胞单层的EPCs数量，老年组明显低于青年组(P<0.05)，见图2。

2.4EPCs体内再内皮化实验结果相比于PBS组〔(12±3)%〕，青年组〔(58±9)%〕和老年组〔(34±7)%〕内皮祖细胞损伤血管内皮化面积明显更大，老年组比青年组明显少(P<0.01)。见图3。

2.5增龄对血流介导的FMD的影响FMD老年组血流介导的FMD〔(6.3±1.1)%〕明显减低(P<0.01)，青年组为(8.8±2.1)%，提示血管内皮功能受损。

2.6血流介导的FMD与内皮祖细胞内皮化的关系无论青年组还是老年组，FMD与EPCs在体内皮化面积之间存在明显正相关(青年组：P<0.01,R2=0.692；老年组：P<0.01,R2=0.641)。见图4。

Scale bar=100 μm图1　EPCs外迁移能力比较(×100)

Scale bar=100 μm图2　EPCs体外黏附能力(×100)

图3　两组志愿者EPCs在体内皮化能力

图4　FMD与EPCs在体内皮化面积相关性分析

3讨论

衰老引起的血管内皮损伤是动脉粥样硬化血管疾病发生和发展的重要环节，而修复血管内皮损伤是防治缺血性血管疾病的重要措施之一。国内外研究表明：血管损伤时，内皮祖细胞能归巢到损伤内皮局部，参与血管内皮损伤修复过程，是血管内皮损伤修复最重要的机制之一〔9～11〕。然而，在心血管危险因素和疾病的存在下，循环中内皮祖细胞的数量和功能均下降，这种内源性血管内皮修复能力的减退是动脉粥样硬化血管疾病发生发展的重要原因〔12,13〕。

在既往的研究中，我们探讨了衰老血管功能与循环内皮祖细胞数量的关系，结果发现衰老引起血管内皮依赖舒张功能受损，而且这种血管功能障碍并且与循环内皮祖细胞数量减少密切相关，提示循环内皮祖细胞数量减少导致的内源性血管修复能力下降是生理性衰老血管损伤的发病机制之一，然而血管衰老与内皮祖细胞的功能活性有待进一步研究。

本研究发现：增龄导致外周循环中内皮祖细胞数量明显下降，培养后的内皮祖细胞体外迁移、黏附功能活性明显降低，提示其血管内皮损伤修复能力可能减弱。通过建立裸鼠颈动脉内皮拉脱损伤模型，结果发现：与年轻人相比，老年人内皮祖细胞颈动脉内皮损伤修复的面积显著减少，这进一步证实衰老导致内皮祖细胞的内源性修复能力的降低。

本研究结果为增龄所致心血管疾病的发生发展提供新思路，即增龄除对血管的直接损伤外，还可能间接通过减弱血管内皮功能修复机制—内皮祖细胞的数量减少和功能减退而导致血管内皮功能障碍，从而促进心血管事件的发生和发展。

4参考文献

1Sniderman AD,Furberg CD.Age as a modifiable risk factor for cardiovascular disease〔J〕.Lancet,2008;371(9623):1547-9.

2Taddei S,Virdis A,Mattei P,etal.Aging and endothelial function in normotensive subjects and patients with essential hypertension〔J〕.Circulation,1995;91(7):1981-7.

3Asahara T,Murohara T,Sullivan A,etal.Isolation of putative progenitor endothelial cells for angiogenesis〔J〕.Science,1997;275(5302):964-7.

4Schmidt-Lucke C,Rössig L,Fichtlscherer S,etal.Reduced number of circulating endothelial progenitor cells predicts future cardiovascular events proof of concept for the clinical importance of endogenous vascular repair〔J〕.Circulation,2005;111(22):2981-7.

5Vasa M,Fichtlscherer S,Aicher A,etal.Number and migratory activity of circulating endothelial progenitor cells inversely correlate with risk factors for coronary artery disease〔J〕.Circ Res,2001;89(1):e1-7.

6Tao J,Jin YF,Yang Z,etal.Reduced arterial elasticity is associated with endothelial dysfunction in person of advancing age:comparative study of noninvasive pulse wave analysis and laser Doppler blood flow measurement〔J〕.Am J Hypertens,2004;17(8):654-9.

7Tao J,Yang Z,Wang JM,etal.Shear stress increases Cu/Zn SOD activity and mRNA expression in human endothelial progenitor cells〔J〕.J Hum Hypertens,2007;21(5):353-8.

8Chen L,Wu F,Xia WH,etal.CXCR4 gene transfer contributes to in vivo reendothelialization capacity of endothelial progenitor cells〔J〕.Cardiovasc Res,2010;88(7):462-70.

9Giannotti G,Doerries C,Mocharla PS,etal.Impaired endothelial repair capacity of early endothelial progenitor cells in prehypertension:relation to endothelial dysfunction〔J〕.Hypertension,2010;55(6):1389-97.

10Lamping K.Endothelial progenitor cells sowing the seeds for vascular repair〔J〕.Circ Res,2007;100(9):1243-5.

11Steinmetz M,Nickenig G,Werner N.Endothelial-regenerating cells:an expanding universe〔J〕.Hypertension,2010;55(3):593-9.

12Zhang XY,Su C,Cao Z,etal.CXCR7 upregulation is required for early endothelial progenitor cell-mediated endothelial repair in patients with hypertension〔J〕.Hypertension,2014;63(2):383-9.

13Fadini GP,de Kreutzenberg S,Albiero M,etal.Gender differences in endothelial progenitor cells and cardiovascular risk profile:the role of female estrogens〔J〕.Arterioscler Thromb Vasc Biol,2008;28(5):997-1004.

〔2015-12-14修回〕

(编辑徐杰)

基金项目：国家自然科学基金资助项目(81200249)；广东省科技计划项目(2016A020215056)；中山大学附属第一医院优秀青年人才计划(2012年)；中山大学青年教师培育项目(2014年)

通讯作者：陶军(1961-)，男，教授，博士，博士生导师，主要从事动脉粥样硬化性心血管疾病研究。

〔中图分类号〕R543.3

〔文献标识码〕A

〔文章编号〕1005-9202(2016)13-3149-04；

doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.13.024

Effects of aging on the number and functional activity of endothelial progenitor cells and the relationship between vascular endothelial function

XIA Wen-Hao, ZHANG Bin, LIANG Jian-Wen,et al.

Department of Hypertension and Vascular Disease, the First Affiliated Hospital, Sun Yat-Sen University, Guangzhou 510080, Guangdong, China

【Abstract】ObjectiveTo investigate the effect of aging on the quantity and functional activities of circulating endothelial progenitor cells (EPCs) in healthy men.Methods32 healthy old people〔elderly group:(68±6.6) years old〕 and 32 healthy young people〔young group:(26±5.8) years old〕were enrolled into the research.EPCs were isolated and cultured from peripheral blood by density gradient centrifugation method, and the quantity of circulating EPCs was exterminated by flow cytometry analysis.Further, the migration and adhesion function in vitro and the reendothelialization capacity in vivo of EPCs from two groups subjects were measured.Moreover, the flow-mediated dilatation of two group subjects were exterminated.ResultsCompare with those of young group, the quantity (P<0.01), in vitro migration and adhesion (P<0.01) and in vivo reendothelialization capacity (P<0.001) of EPCs from aging group were significant declined.And the impaired endothelial repair capacity was positive relation with declined FMD.ConclusionsAge-related decline in quantity and function of human EPCs is close relation with decreasing endothelial function, which is an important risk factor for atherosclerotic vascular diseases.

【Key words】Aging;Endothelial injury;Endothelial function;Endothelial progenitor cells

·心、脑血管及代谢性疾病·

第一作者：夏文豪(1978-)，男，主治医师，主要从事老年心血管疾病的基础与临床研究。