增龄对大鼠阴茎海绵体内硫化氢信号通路的影响

曾　锋　杜从林　海　波　罗振国　迟宝进　桂士良

(麻城市人民医院泌尿外科，湖北　麻城　438300)



增龄对大鼠阴茎海绵体内硫化氢信号通路的影响

曾锋杜从林1海波2罗振国1迟宝进1桂士良1

(麻城市人民医院泌尿外科，湖北麻城438300)

〔摘要〕目的研究增龄对大鼠阴茎海绵体组织中硫化氢(H2S)信号通路的影响从而进一步明确老年性勃起功能障碍(ED)的发病机制。方法随机分别挑选3、9、18月龄雄性健康Wistar大鼠(相同月龄组体重相近)各10只并按3、9、18月龄依次分为A、B、C组。三组适应性喂养2 w后行阴茎海绵体内压/平均颈动脉压(ICPmax/MAP)值的检测，而后采血以测定血浆H2S浓度，处死大鼠取阴茎组织以检测阴茎组织H2S含量及生成率，各组阴茎海绵体组织内胱硫醚-β-合成酶(CBS)与胱硫醚-γ-裂解酶(CSE)的含量用Western印迹法测出。结果随着月龄增长，ICPmax/MAP(5、7 V)值均依次显著减小(P<0.05)，血浆H2S浓度、阴茎海绵体组织H2S含量及生成率均依次显著性降低(P<0.05)，阴茎组织内CSE和CBS的含量也分别明显减低(P<0.05)。结论增龄中，大鼠阴茎组织内CSE和CBS表达减弱，内源性H2S减少，这可能是大鼠老年性ED致病机制之一。

〔关键词〕硫化氢；胱硫醚-β-合成酶；增龄；胱硫醚-γ-裂解酶；勃起功能障碍

勃起功能障碍(ED)的发病与诸多因素如老龄、糖尿病、前列腺疾病、高血压等密切相关〔1〕。关于老年性ED的发病机制除了与阴茎组织内一氧化氮(NO)和一氧化碳(CO)含量下降有关外，老年性ED大鼠阴茎海绵体中内源性硫化氢(H2S)含量下降也是其发病原因之一〔2〕。内源性H2S是在关键酶-胱硫醚-β-合成酶(CBS)和胱硫醚-γ-裂解酶(CSE)催化下将半胱氨酸作为底物产生的。本实验通过检测H2S 信号通路中关键酶(CSE 和CBS)在不同月龄大鼠阴茎海绵体组织内含量的改变来深入探讨老年性ED的发病原因。

1材料与方法

1.1动物于佳木斯大学动物实验中心分别随机挑选3、9、18月龄健康雄性Wistar大鼠各10只，同月龄组体重相差均在30 g内，根据月龄分为3、9、18月龄组，分别记为A、B、C组。同条件下给予3组普通饲料及饮水持续喂养2 w，温度为(21±3)℃，湿度为(66±4)%。

1.2主要仪器及试剂RM6240型多导生理信号采集处理系统(成都仪器厂)，数显式稳压稳流电泳仪与转移电泳槽(上海天能)，兔抗大鼠CSE多克隆抗体(Proteintech Group，美国)，鼠抗β-actin抗体(中杉金桥，北京)，兔抗大鼠CBS多克隆抗体(ABclonal，美国)，辣根过氧化物酶(HRP)标记的山羊抗兔IgG与山羊抗鼠IgG(博士德，武汉)。

1.3阴茎海绵体内压(ICP)/平均颈动脉压(MAP)测定第2周末参照文献〔2〕方法行ICPmax/MAP测定，对每只大鼠腹腔注射戊巴比妥钠(1%，50 mg/kg)麻醉后行右侧颈总动脉插管，记录MAP值。自龟头至耻骨联合剪开阴茎背侧皮肤并用玻璃针逐步仔细游离出右侧阴茎海绵体，将22G针头充满肝素盐水并插入阴茎海绵体后排空管内空气，连接压力换能器，检测ICP变化。于腹部正中打开腹腔，解剖显微镜下找出盆神经节(紧邻前列腺的后外侧缘)并给予相应电刺激(电刺激参数：5、7 V，25 Hz，2 ms，持续刺激1 min暂停5 min后可重复)，用RM6240型多导生理信号采集处理系统记录第1、7分钟稳定的ICP和MAP值。

1.4血浆H2S浓度检测海绵体测压后采血2 ml并离心取上清，取1.5 ml Eppendorf(EP)管，依次加入0.4 ml三蒸水、醋酸锌(1%，250 μl)、对苯二铵盐酸盐(20 mmol/L，133 μl)及三氯化铁(30 mmol/L，133 μl)后室温孵育10 min，向上述EP管中加入三氯醋酸(10%，0.25 ml)后离心10 min(4℃，17 500 r/min)，将上清液加样于孔板后测670 nm的吸光度，由NaHS标准曲线算得血浆H2S浓度〔3～5〕。

1.5测定阴茎海绵体中H2S含量和生成率测压及采血后处死大鼠，分离出阴茎海绵体组织并净化脱血，将磷酸盐缓冲液(PBS)(0.10 mol/L，pH7.4)与海绵体组织按10∶1比例制成匀浆，取1.5 ml EP管，依次加入组织匀浆500 μl、20 μl L-半胱氨酸(10 mmol/L)、生理盐水30 μl和20 μl 5-磷酸吡哆醛(2 mmol/L)，置于温水(37℃)中反应30 min后依次各加入0.25 ml的1%(W/V)乙酸锌和0.25 ml的10%(W/V)三氯乙酸，水浴(37℃)60 min后加入对苯二铵盐酸盐(20 mmol/L)和三氯化铁(30 mmol/L)均133 μl，20 min后加样于孔板中，测670 nm处吸光度并算出阴茎海绵体中H2S含量及生成率〔3～5〕。

1.6Western印迹检测阴茎海绵体中CSE与CBS的含量取阴茎海绵体组织称重并液氮下充分研磨，将裂解液和海绵体组织以10∶1比例进行匀浆，离心后取上清并按聚氰基丙烯酸正丁酯(BCA)法测样品蛋白浓度，以30 μg总蛋白进行加样、电泳、转膜、封闭(37℃，1 h)，加入一抗(1∶1 000兔抗大鼠CBS/CSE多克隆抗体)后孵育过夜(4℃)，吐温-20的Tris-HCl缓冲液(TBS-T)洗膜3次(15 min/次)后37℃下孵育二抗(1∶3 000被HRP标记的羊抗兔IgG)1 h，TBS-T洗膜4次(15 min/次)后滴加现配的发光液，保鲜薄膜单层包裹后固定于暗盒内，暗室曝光10～20 s后显影及定影。1∶500鼠抗β-actin抗体为内参，CSE/CBS/β-actin值代表相对蛋白含量。底片光密度指数用IBAS2.0图像分析系统分析。

1.7统计学方法采用SPSS17.0统计软件进行LSD-t检验。

2结果

2.1ICPmax/MAP的比较随着月龄增大，ICPmax/MAP(5、7 V)值依次显著性减小，A组(0.64±0.06，0.72±0.07)>B组(0.47±0.05，0.51±0.08)>C组(0.32±0.05，0.35±0.06)，B组与A组、C组与B组差异均有显著性(P<0.05)。

2.2血浆和阴茎海绵体内H2S含量与生成率比较血浆H2S浓度、海绵体组织H2S的含量和生成率都随月龄增加而显著性下降(P<0.05)。见表1。

表1　各组血浆H2S浓度、阴茎海绵体内H2S含量及生成率比较

与A组比较：1)P<0.05；与B组比较：2)P<0.05

2.3阴茎组织中CSE和CBS含量比较随着大鼠月龄增大，阴茎组织内CSE(0.64±0.11、0.48±0.09、0.37±0.13)和CBS(0.49±0.08、0.29±0.06、0.18±0.05)的含量均依次显著性降低(P<0.05)。见图1。

图1　各组阴茎海绵体组织内CSE和CBS表达的Western印迹结果

3讨论

流行病学调查显示，全球ED患者约1.5亿〔6〕。老龄、心理因素、手术、血管性疾病和内分泌疾病等均可导致ED，已证实衰老是ED发生的主要危险因素〔7〕，随着年龄的增长，ED的患病率也逐渐增高。关于ED美国研究发现60岁以上男性的患病率为50岁以下的2倍〔8〕，国内研究显示，约4.3%的30～60岁男性患有ED，40～49岁患病率为4.3%，而50～59岁患病率为9.8%〔9〕。本实验结果证实ED发病与增龄关系密切。

增龄中ED发生的具体机制较复杂，存在多种可能。李付彪等〔10〕研究发现随大鼠月龄增大，阴茎组织内合酶(NOS)活性与含量下降，致使海绵体中NO含量减少及鸟苷酸环化酶途径受阻而出现ED。秦文波等〔11〕研究认为增龄使阴茎组织中血红素氧合酶(HO)和CO的含量明显减少，最终导致ED发生。而Ferrini等〔12〕发现随着月龄增大，阴茎海绵体内活性氧和胶原纤维沉积增多、平滑肌细胞减少等，最终发生ED。据研究显示老龄大鼠阴茎海绵体内超氧阴离子(一种活性氧产物)是青年组的3倍，认为阴茎组织内活性氧随增龄而增多，损伤阴茎海绵体的平滑肌细胞、血管内皮细胞及神经细胞并致NO介导的平滑肌舒张功能障碍〔13〕。RhoA/Rho 激酶具有收缩阴茎血管的作用，而降钙素基因相关肽(CGRP)是一种具有强效舒血管活性的多肽物质，老龄大鼠ED的发生与阴茎海绵体组织中RhoA/Rho 激酶增多和CGRP减少密切相关〔14〕。另外，增龄所致的中枢调节勃起功能机制减退、性激素水平降低及伴发多种其他疾病(糖尿病、冠状动脉粥样硬化等)均是老年性ED的可能病因。此外，阴茎组织内源性H2S与老年性ED的发生也密切相关，但其具体机制有待进一步研究明确。内源性H2S主要由依赖5-磷酸吡多醛的酶(CSE和CBS)将体内的半胱氨酸转化而来的，其中CSE主要分布于各种神经系统内，而CBS存在于平滑肌及各种脏器如心、肝、肾脏等组织内。H2S与NO及CO相似，在舒张平滑肌和改善阴茎勃起功能方面起着重要作用。H2S不仅可以促使恢复脑卒中后神经功能，一方面通过有效增加谷胱甘肽(GSH)生成并清除氧自由基，抑制脂质过氧化反应，减少血管聚积的过氧化反应产物，抗动脉粥样硬化，保护血管内皮功能并避免内皮功能损伤，另一方面通过抑制平滑肌细胞增殖并诱导其凋亡来抑制血管重构〔15〕。H2S对平滑肌的舒张作用仅部分能被腺苷酸环化酶阻滞剂所阻断，故H2S调节舒张功能除依赖cAMP 的调节机制外，还可通过其他机制来调节平滑肌的舒张〔16〕。据文献显示，H2S还能通过依赖ATP敏感的钾离子通道(K+-ATP)介导途径、直接作用于Cl-/HCO3-通道及与睾酮和CO协同作用的方式来调节平滑肌的舒张〔17〕。此外H2S还可以增加阴茎海绵体内NOS和NO的含量来促进阴茎勃起〔18〕，但也有学者认为NO使CSE 活性降低而抑制H2S的舒张效应〔19〕，目前H2S与NO的关系尚不明确。

综上，由于增龄中各种因素如动脉粥样硬化、氧自由基增多、平滑肌内皮损伤等致使阴茎海绵体组织内CSE和CBS活性与含量降低，内源性H2S含量减少，阴茎组织产生H2S能力减弱，这可能是增龄所致ED的机制之一。

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11秦文波，王淑秋，李明，等.不同月龄大鼠阴茎组织中内源性一氧化碳与环磷酸鸟苷和环磷酸腺苷的关系〔J〕.中华男科学杂志，2009;19(4):296-9.

12Ferrini MG，Davila HH，Valente EG，etal.Aging-related induction of inducible nitric oxide synthase is vasculo-protective to the arterial media〔J〕.Cardiovasc Res，2004;61(4):796-805.

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19Zhao W，Wang R.H2S-induced vasorelaxation and underlying cellular and molecular mechanisms〔J〕.Am J Physiol Heart Circ Physiol，2002;283(2):H474-80.

〔2015-03-19修回〕

(编辑苑云杰)

基金项目：黑龙江省自然科学基金(H2015073)；黑龙江省卫生厅科研课题(2013-229)；佳木斯大学校级自然科学类青年项目(Sq2013-025)

通讯作者：迟宝进(1981-)，男，硕士，主治医师，主要从事勃起功能障碍及前列腺癌研究。

〔中图分类号〕R698+.1

〔文献标识码〕A

〔文章编号〕1005-9202(2016)12-2852-03；

doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.12.011

1佳木斯大学附属第一医院泌尿外科

2华中科技大学同济医学院附属协和医院泌尿外科

第一作者：曾锋(1981-)，男，主治医师，主要从事泌尿外科及勃起功能障碍研究。