孤独症谱系障碍核心家系染色体核型分析研究☆

卢天兰伍智镠阮燕燕贾美香岳伟华李俊王力芳张岱

孤独症谱系障碍核心家系染色体核型分析研究☆

卢天兰*※伍智镠*※阮燕燕*贾美香*岳伟华*李俊*王力芳*张岱*

目的 分析中国汉族人群孤独症谱系障碍核心家系的染色体核型特征，并筛查染色体畸变，探讨患者染色体畸变区域是否存在拷贝数变异和神经发育相关基因，为寻找孤独症谱系障碍的遗传病因提供线索。方法 采用G带显色技术并依据人类细胞遗传学国际命名体制（International System for Human Cytogenetic Nomenclature，ISCN）对632个孤独症谱系障碍核心家系（包括632例患者及其健康生物学父母1264名）进行染色体核型分析，并根据各染色体带型特征筛查染色体数目和结构畸变情况。经与细胞遗传学芯片标准化联盟（International Standards for Cytogenomic Arrays，ISCA）数据库和人类亚微观结构基因组变异和疾病表型数据库（Database of genomic variation and Phenotype in Humans using Ensembl Resource，DECIPHER）比对，探讨检出的染色体畸变区域是否可能存在与孤独症谱系障碍和神经发育相关的致病性拷贝数变异和基因。结果 共检出携带染色体畸变的患者22例，占患者3.48%（22/632）。其中5例为新生畸变，在患者中检出率为0.79%（5/632），包括1例重复，1例平衡易位，2例Turner综合征核型，1例21q22区域额外未知来源片段；另外17例染色体畸变为父母遗传，占患者2.69%（17/632）。经数据库比对，检出的染色体1q25和3p24畸变区域可能存在致病性较高的拷贝数变异，并累及TNR、ASTN1、NMNAT2等神经发育相关基因。结论 部分孤独症谱系障碍患者存在新生染色体畸变；染色体畸变区域可能存在累及神经发育相关致病基因的拷贝数变异。染色体核型分析可为寻找孤独症谱系障碍的遗传病因提供线索。

孤独症 核型分析 染色体畸变

【Abstract】Objective To detect chromosomal aberrations of autism spectrum disorder（ASD），we performed karyotypes analyses in 632 ASD trios and then investigated whether copy number variants and neurodevelopment related genes are present in the regions of chromosomal aberrations.Methods Karyotypes analyses were performed in 632 ASD trios （1896 individuals）.In addition，we investigated whether there were pathogenic copy number variants located in the relevant regions of detected aberrant karyotypes by using the database of the International Standards for Cytogenomic Arrays （ISCA）and the Genomic Variation and Phenotype in Humans using Ensembl Resources（DECIPHER）for ASD patients. Results We detected aberrant results in 22 of 632 patients（3.48%）by karyotypes analyses.Of these 22 aberrant karyotypes，5 were de novo（0.79%），including the duplication，the translocation，karyotypes of Turner syndrome and the additional material with unknown origin.Seventeen children affected with autism had aberrant karyotypes inherited from oneof their parents.By using the ISCA and the DECIPHER database，we found that several copy number variants with high pathogenicity were located in 1q25 and 3p24.Further，these copy number variants consisted of several genes related to neurodevelopment such asTNR，ASTN1，andNMNAT2.Conclusion There are a few de novo chromosomal aberrations in some patients affected with ASD.Copy number variants of several pathogenic neurodevelopmental related genes may exist in the regions of chromosomal aberrations.Karyotypes analyses may be applied to explore the genetic etiology in some patients affected with ASD.

【Key words】Autism Karyotyping Chromosomal aberrations

孤独症谱系障碍是一组严重的神经发育疾病，遗传因素在其发病中具有重要作用［1-3］。染色体是细胞内遗传物质的载体，核型分析有助于发现染色体数目和结构变异。国外细胞遗传学研究表明孤独症谱系障碍患者存在染色体结构变异［3-4］。孤独症谱系障碍患者中发生平衡性染色体重排和不平衡性染色体结构变异（如缺失、重复）的概率分别为5%和2%～6%［3-4］。研究发现染色体畸变区域可能存在累及神经精神障碍和脑发育相关基因的拷贝数变异［5］。目前我国尚缺少大样本的孤独症谱系障碍染色体核型数据，尤其缺乏孤独症谱系障碍核心家系的染色体核型分析，导致不能筛查患者新生染色体畸变。故本研究对632个孤独症谱系障碍核心家系进行染色体核型分析，继而探讨染色体畸变区域是否可能存在致病性拷贝数变异并累及基因。

1　对象与方法

1.1研究对象 招募自2009年1月1日至2014年12月31日于北京大学第六医院诊断为孤独症谱系障碍的患者及其健康生物学父母。患者入组标准：①年龄≤18岁，汉族；②符合《美国精神障碍诊断与统计手册第四版》（Diagnostic and Statistical Manual of Mental Disorders，Fourth Edition，DSM-Ⅳ）孤独症、阿斯伯格综合征（Asperger syndrome）或未特定广泛性发育障碍（pervasive developmental disorder-not otherwise specified，PDD-NOS）的诊断标准，由2名儿童精神科主任医师进行诊断；②孤独症患者儿童孤独症评定量表（childhood autism rating scale，CARS）＞36分；③孤独症患者孤独症行为量表（autism behavior checklist，ABC）≥53分。患者排除标准：①患有苯丙酮尿症、脆性X染色体综合征或结节性硬化；②患有其他严重躯体疾病；③通过2名儿童精神科主任医师详细询问生长发育史和精神检查等，诊断合并符合DSM-Ⅳ诊断标准的其他轴Ⅰ精神障碍。患者父母入组标准：①患者生物学父亲与母亲，汉族；②无精神障碍和严重躯体疾病病史；③无家族性遗传病史。本研究由北京大学精神卫生研究所伦理委员会批准。所有研究对象均详细了解本研究的目的和内容，并签署知情同意书；孤独症谱系障碍患儿由其法定监护人签署知情同意书。

1.2研究方法

1.2.1人外周血淋巴细胞培养 所有研究对象于晨起抽取外周静脉血5 mL于肝素抗凝的离心管中。之后将抗凝全血0.3 mL接种到1640混合培养基（北京易市盛达科技发展有限公司），37℃培养72 h。于70 h加入秋水仙素，作用2 h后收获细胞。

1.2.2染色体标本制备将培养物移入离心管，离心后弃去上清，加入低渗液，37℃水浴28 min；加少量固定液后用吸管吹匀，再次离心。弃掉上清液，加入固定液5～6 mL，固定15 min，2500 r/min离心10 min，去掉上清液，再次加入固定液，用吸管吹匀后离心。弃掉上清后则制成合适的外周血淋巴细胞悬液。

1.2.3染色体G显带处理 细胞悬液加入几滴固定液后滴片。每份样本滴片2张，滴片后自然干燥，次日70℃烤片3 h。用0.2%的胰酶/生理盐水处理滴好的载玻片15 s，生理盐水涮洗两次，Giemsa工作液扣染20 min后，冲洗去除多余染液，室温下晾干，以确保标本经染液充分显色。显色后的染色体在光镜下可呈现明暗相间的带纹，即为染色体带型。镜下观察染色体带型是否清晰。

1.2.4核型分析 显带处理好的载玻片在Olympus BX-51显微镜放大倍数1000倍下观察清晰的染色体中期分裂相，应用Applied Imaging（AI）公司细胞遗传学工作站进行图像采集，并依据人类细胞遗传学国际命名体制（International System for Human Cytogenetic Nomenclature，ISCN）进行核型分析。镜下观察染色体的数目是否存在单体、缺体、三体和多体等情况；与正常标准的染色体带纹进行比较，观察各染色体特征性的带型是否发生变化，是否存在缺失、重复、倒位、易位，有无等臂染色体、环状染色体等染色体结构畸变。人工判读染色体核型，由另一人进行审核后确定染色体核型分析结果。

1.2.5数据库比对染色体畸变区域的致病性拷贝数变异及基因 细胞遗传学芯片标准化联盟（International Standards for Cytogenomic Arrays，ISCA）数据库由临床细胞遗传学和分子遗传学实验室数据共同构建，包括大量不明原因的发育迟缓（unexplained developmental delay）、孤独症（autism）、智力障碍（intelligence disability）和其他发育障碍（other developmental disorders）儿童的细胞遗传学芯片检测结果。人类亚微观结构基因组变异和疾病表型数据库（Database of genomic variation and Phenotype in Humans using Ensembl Resource，DECIPHER）包含多种疾病患者的拷贝数变异信息，其中孤独症患者1084例。ISCA和DECIPHER数据库的芯片结果在录入之前，均依据美国医学遗传学会指南［6］，评估染色体指定区域累及的拷贝数变异是否具有致病效应。应用ISCA和DECIPHER数据库，以“孤独症”或“孤独症谱系障碍”作为筛选标准，将本研究检出的染色体畸变区域与数据库进行比对，分析可能累及的拷贝数变异及基因。

1.3统计学方法 采用SPSS 20.0进行数据录入与分析。Kolmogorov-Smirnov（K-S）单样本检验示患者及其父母年龄为非正态分布，采用中位数（下四分位数，上四分位数）［M（QL，QU）］进行统计描述；各类染色体畸变核型占患者总人数的比例采用构成比（%）描述。

2　结果

2.1研究对象一般情况 本研究共纳入632个中国汉族孤独症谱系障碍核心家系，包括632例患者及其健康生物学父母1264名，共1896人。患者中男性554例，女性78例，年龄中位数4.83（3.50，7.00）岁；孤独症624例，阿斯伯格综合征1例，未特定的广泛性发育障碍7例。健康生物学父母共1264名，父亲年龄中位数34.00（32.00，37.00）岁，母亲年龄中位数32.00（30.00，35.00）岁。

2.2孤独症谱系障碍核心家系染色体核型分析结果 632例孤独症谱系障碍患者中，共发现染色体畸变22例，占3.48%（22/632），其中男性18例，女性4例。有染色体畸变患者中5例为新生的染色体畸变，占患者0.79%（5/632），其中男性1例，女性4例；包括1例重复（46，XX，dup（1）（q25；q31），1例平衡易位（46，XX，t（5；18）（p10；q10），2例Turner综合征核型（mos45，X［73］/46，X，i（X）（q10）［27］；46，X，i（X）（q10），以及1例21q22区域额外未知来源片段，即发现21q22有一增加片段，但无法判断该片段的来源（46，XY，add（21）（q22）。见表1。其余17例染色体畸变均为父母遗传，占患者2.69%（17/632），9例为父亲遗传，8例为母亲遗传。遗传的染色体畸变中，9号染色体臂间倒位共13例，包括12例46，XY，inv（9）（p13；q12）和1例46，XY，inv（9）（p21；q21）。见表2。

表1 5例新生染色体畸变患者信息

2.3检出染色体畸变区域的致病性拷贝数变异比对结果 经与ISCA和DECIPHER数据库比对，本研究检出的染色体畸变区域存在致病性拷贝数变异共12例，其中缺失拷贝数5例，重复拷贝数7例。见表3与表4。DECIPHER数据库提示，1q25、3p24区域可能存在致病性较高的拷贝数变异，且累及与神经发育和神经元活动相关的基因，如TNR、ASTN1、NMNAT2和KCNH8等基因。见表3。染色体9p12、9q13区域在两个数据库中均未发现致病性的拷贝数变异。

表2 22例染色体畸变核型分析结果

表3检出染色体畸变区域可能累及的致病性拷贝数变异及基因

3　讨论

本研究采用家系设计，筛查孤独症谱系障碍患者新生染色体畸变，有助于寻找孤独症谱系障碍的遗传病因［4，6］。本研究发现携带新生染色体畸变的患者占患者0.79%（5/632），与SHEN等［7］报道的0.94%（8/852）基本一致。而携带染色体畸变的患者占患者总人数3.48%（22/632），稍高于SHEN等［7］2.23%（19/852）的结果，原因可能与种族差异及不同研究的抽样误差不同有关。本研究发现的5例新生染色体畸变中，Turner综合征核型在既往研究中曾有报道［2］，另外3例（46，XX，dup（1）（q25；q31）；46，XX，t（5；18）（p10；q10）；46，XY，add（21）（q22）既往研究未曾报道。此3例新生染色体畸变区域累及部分与神经发育相关的基因，如TNR（1q25）、NMNAT2（1q25）和DYRK1A（21q22.13）基因［8-10］。另有研究发现DYRK1A基因的新生突变与孤独症有关［11］，提示新生染色体畸变可能是部分患者的致病原因，并且TABET等［4］在孤独症谱系障碍患者新生的平衡性染色体重排中，发现断裂点位置拷贝数变异累及参与突触形成的EPB41L3基因，而突触形成参与建立的神经环路在孤独症谱系障碍的致病机制中有重要作用。本研究发现Turner综合征核型携带者具有孤独症谱系障碍的临床表型，与既往研究结果一致［2，12］，提示临床工作中应考虑女性孤独症谱系障碍患者携带此类核型的可能性，通过核型分析可进一步明确诊断。本研究发现9号染色体的臂间倒位占所有染色体畸变的半数以上，且均为父母遗传，而父母无孤独症谱系障碍的临床表型。SHEN等［7］的研究也曾报道此类核型，提示9号染色体臂间倒位可能是一种在人群中广泛存在的染色体结构变异。此外，有研究报道高加索人群中的孤独症患者存在15q11-q13区域的重复［3，5］，但本研究未发现该区域的重复，提示不同种族患者畸变区域和致病原因可能存在差异。

表4检出染色体畸变区域累及致病性拷贝数变异

经与数据库比对，本研究中部分染色体畸变区域（如1q25和3p24.3）可能存在与孤独症谱系障碍相关的致病性拷贝数变异和基因。位于染色体1q25区域的部分受累基因与神经发育有关，如ASTN1基因和TNR基因在神经系统广泛表达并且影响神经元的迁移与分化［8，13］；NMNAT2基因则参与神经元轴突的生长［9］。一项全基因组关联研究提示位于3p24.3的ZNF385D基因与语言受损、阅读困难等疾病症状相关［14］。另外，位于该区域的KCNH8基因可能调节神经递质释放及神经元兴奋性［15］。以上结果提示部分染色体畸变区域累及与神经发育相关的基因，可能与孤独症谱系障碍有关。

综上所述，本研究对632个孤独症谱系障碍核心家系（共1896人）进行染色体核型分析，发现部分患者存在新生的染色体畸变，且部分畸变区域累及拷贝数变异和神经发育相关基因。染色体核型分析有助于寻找孤独症谱系障碍的部分遗传病因。本研究尚有不足之处，如未能深入分析染色体畸变区域累及拷贝数变异和基因。今后将进一步探索基因组水平上的亚显微结构变化，为孤独症谱系障碍的分子遗传学研究提供新线索。

［1］CONSTANTINO JN，ZHANG Y，FRAZIER T，et al.Sibling recurrence and the genetic epidemiology of autism［J］.Am J Psychiatry，2010，167（11）：1349-1356.

［2］DEVLIN B，SCHERER SW.Genetic architecture in autism spectrum disorder［J］.Curr Opin Genet Dev，2012，22（3）：229-237.

［3］MURDOCH JD，STATE MW.Recent developments in the genetics of autism spectrum disorders［J］.Curr Opin Genet Dev，2013，23（3）：310-315.

［4］TABET AC，VERLOES A，PILORGE M，et al.Complex nature of apparently balanced chromosomal rearrangements in patients with autism spectrum disorder［J］.Mol Autism，2015，6：19.

［5］赵雪，张燕霞，禹顺英.孤独症谱系障碍的易感性拷贝数变异研究进展［J］.中国神经精神疾病杂志，2014，40（7）：447-448.

［6］KEARNEY HM，THORLAND EC，BROWN KK，et al.American College of Medical Genetics standards and guidelines for interpretation and reporting of postnatal constitutional copy number variants［J］.Genet Med，2011，13（7）：680-685.

［7］SHENY，DIES KA，HOLM IA，et al.Clinical genetic testing for patients with autism spectrum disorders［J］.Pediatrics，2010，125（4）：e727-735.

［8］ANLAR B，GUNEL-OZCAN A.Tenascin-R：role in the central nervous system ［J］.Int J Biochem Cell Biol，2012，44（9）：1385-1389.

［9］GILLEY J，COLEMAN MP.Endogenous Nmnat2 is an essential survival factor for maintenance of healthy axons［J］.PLoS Biol，2010，8（1）：e1000300.

［10］TEJEDOR FJ，HAMMERLE B.MNB/DYRK1A as a multiple regulator of neuronal development［J］.FEBS J，2011，278（2）：223-235.

［11］VAN BON BW，COE BP，BERNIER R，et al.Disruptive de novo mutations of DYRK1A lead to a syndromic form of autism and ID［J］.Mol Psychiatry，2016，21（1）：126-132.

［12］KNICKMEYER RC，DAVENPORT M.Turner syndrome and sexual differentiation of the brain：implications for understanding male-biased neurodevelopmental disorders［J］.J Neurodev Disord，2011，3（4）：293-306.

［13］WILSON PM，FRYER RH，FANG Y，et al.Astn2，a novel member of the astroactin gene family，regulates the trafficking of ASTN1 during glia-guided neuronal migration［J］.J Neurosci，2010，30（25）：8529-8540.

［14］EICHER JD，POWERS NR，MILLER LL，et al.Genome-wide association study of shared components of reading disability and language impairment［J］.Genes Brain Behav，2013，12（8）：792-801.

［15］WISNIEWSKA MB，NAGALSKI A，DABROWSKI M，et al. Novel beta-catenin target genes identified in thalamic neurons encode modulators of neuronal excitability［J］.BMC Genomics，2012，13：635.

（责任编辑：肖雅妮）

Karyotypes analyses in 632 autism spectrum disorder trios.

LU Tianlan，WU Zhiliu，RUAN Yanyan，JIA Meixi-ang，YUE Weihua，LI Jun，WANG Lifang，ZHANG Dai.Institute of Mental Health，The Sixth Hospital，Peking University；Key Laboratory of Mental Health，Ministry of Health&National Clinical Research Center for Mental Disorders（Peking University），Beijing 100191，China.Tel：010-82801960.

R749.94

A

10.3969/j.issn.1002-0152.2016.03.005
☆国家自然科学基金（编号：81471383）；首都临床特色应用研究专项（编号：Z131107002213100）
*北京大学精神卫生研究所，北京大学第六医院，卫生部精神卫生学重点实验室（北京大学），国家精神心理疾病临床研究中心（北京 100191）
※共同第一作者

（E-mail：lifangwang@bjmu.edu.cn；junli1985@bjmu.edu.cn）

2015-11-22）