硫氧还蛋白相互作用蛋白表达下调减轻大鼠蛛网膜下腔出血后早期脑损伤☆

赵清车旭东谭关平张红霞蒋登志孙晓川何朝晖

硫氧还蛋白相互作用蛋白表达下调减轻大鼠蛛网膜下腔出血后早期脑损伤☆

赵清*车旭东*谭关平*张红霞*蒋登志*孙晓川*何朝晖*

目的 观察大鼠蛛网膜下腔出血（subarachnoid hemorrhage，SAH）后早期硫氧还蛋白相互作用蛋白（thioredoxin-interacting protein，TXNIP）表达变化，检测干预前后TXNIP及下游凋亡因子表达，探讨TXNIP参与SAH后早期脑损伤（early brain injury，EBI）的可能机制。方法 血管内穿刺法建立SAH模型。97只成年雄性SD大鼠，随机分为假手术对照组（Sham组，17只）、SAH组（32只）、Control siRNA组（12只）、TXNIP siRNA组（12只）、白藜芦醇（resveratrol，RES）对照组（12只）、RES干预组（12只）。Western blot检测SAH后各时间点及干预前后TXNIP、p-ASK-1、Caspase-3表达变化，荧光共聚焦检测TXNIP在神经元定位，TUNEL法检测细胞凋亡与TXNIP共定位，同时进行脑水肿评估（6只/组）和行为学评分（12只/组）。结果 采用TXNIP siRNA和TXNIP抑制剂RES干预后死亡率、行为学评分及脑水肿（F=7.964，P＜0.05）得到改善。荧光共聚焦显示TXNIP在大鼠脑神经元广泛表达，且主要位于胞浆。荧光TUNEL提示TXNIP与皮层区及海马区凋亡细胞共定位。Western blot发现与Sham组（0.476±0.043，n=3）比较，TXNIP在SAH后12h（0.729±0.548）表达逐渐增高，72h（1.509±0.071）仍处于较高水平，同时伴随下游凋亡因子的增高，差异有统计学意义（F=7.806，P＜0.05）。采用TXNIP siRNA和TXNIP抑制剂RES干预后，TXNIP表达下调（F=900.849，P＜0.05，n=3），下游凋亡因子出现下降（p-ASK1，F= 32.897，P＜0.05；Caspase-3，F=89.120，P＜0.05）。结论 大鼠SAH后早期TXNIP表达增加，通过其促凋亡机制参与EBI发生，下调TXNIP能减轻大鼠SAH后EBI，这可能为临床SAH早期治疗提供新的治疗思路。

硫氧还蛋白相互作用蛋白蛛网膜下腔出血早期脑损伤细胞凋亡

【Abstract】Objective To explore the possible mechanism by which thioredoxin-interacting protein（TXNIP）participated in early brain injury（EBI）of subarachnoid hemorrhage（SAH）via examination of the expression of TXNIP and its downstream apoptotic factors before and after intervention.Methods Subarachnoid Hemorrhage（SAH）was performed by endovascular perforation.Total 97 adult male SD rats were randomly divided into 6 groups：sham-operation（17），SAH （32），control siRNA（12），TXNIP siRNA（12），resveratrol control（12）and resveratrol injection（12）.Western blot was used to examine the expression of TXNIP，p-ASK-1，Caspase-3 before and after intervention.Laser scanning confocal microscopy（LSCM）was used to detect the expression of TXNIP in neurons.The co-localization of TXNIP with apoptoticcells was examined by using fluorescent TUNEL.Mortality，behavior score and cerebral edema were also evaluated.Results Mortality，behavior scores and brain edema were improved after TXNIP siRNA and resveratrol injection（P＜0.05）. LSCM showed that TXNIP was widely expressed in brain and mainly located in cytoplasm of neurons in SAH rats.Fluorescent TUNEL revealed the co-localization of TXNIP with apoptotic cells.The expression level of TXNIP was significantly higher in SAH group than in sham operation（P＜0.05，n=3）.The expression level of TXNIP gradually increased at 12h and still remained at high level at 72h（P＜0.05）.This increase was simultaneously accompanied by the increase in downstream apoptosis factors，p-ASK-1 and Caspase-3.Inhibition of TXNIP by siRNA or resveratrol significantly reduced the expression of TXNIP，p-ASK-1 and Caspase-3（P＜0.05，n=3）.Conclusion TXNIP gradually increases in early period after SAH and aggravates brain damage through activation of ASK-1 apoptosis signaling pathway，whereas inhibition of TXNIP may attenuate EBI through reduction of p-ASK-1 and Caspase-3 after SAH.

【Key words】Thioredoxin-interacting protein Subarachnoid Hemorrhage Early brain injury Apoptosis

早期脑损伤（early brain injury，EBI）是影响蛛网膜下腔出血（subarachnoid hemorrhage，SAH）患者预后和生存的主要因素，EBI指的是SAH后早期（72h内）发生的一系列病理变化，但其具体机制尚未完全明确，而脑组织细胞凋亡占有重要地位［1］。近年来，硫氧还蛋白相互作用蛋白（thioredoxin-interacting protein，TXNIP）通过其促凋亡促炎机制参与胰腺β细胞死亡、血栓性脑缺血、脑损伤发生，引起糖尿病和脑血管疾病研究领域的广泛重视［2-5］。TXNIP是体内硫氧还蛋白（thioredoxin，TRX）的天然拮抗剂，在高糖、缺血刺激下TXNIP可以绑定、抑制TRX调节细胞氧化还原的作用［6-8］。因此本实验拟采用血管内穿刺法建立SAH模型，观察干预前后TXNIP的表达变化，以期阐明TXNIP与SAH后EBI发生的相关机制。

1　材料与方法

1.1研究对象 健康成年雄性SD大鼠97只，体质量280～320g，由重庆医科大学动物实验中心提供。随机分为Sham组（Sham组，17只）、SAH组（32只）、Control-siRNA组（12只）、TXNIP siRNA组（12只）、白藜芦醇（Resveratrol，RES）对照组（12只）、白藜芦醇组（12只）。穿刺成功后大鼠较术前出现明显神经功能缺损，脑底部可见较明显出血。手术失败或穿刺麻醉过程中死亡不计入上述分组中。

1.2血管内穿刺法 SAH模型制作参照SUZUKI等［9］制作方法，以10%水合氯醛、3mL/kg腹腔麻醉大鼠后取仰卧位固定，常规消毒，分离出右侧颈总动脉、颈外动脉和颈内动脉分叉。提起颈外动脉残端，显微剪剪开一“V'形切口，4-0号尼龙线顺势插入颈内动脉，距颈内外动脉分叉进线1.8～2.0 cm，感阻力后再深入0.2cm，有落空感停止进线。15s后退出尼龙线，结扎颈外动脉残端，松开临时阻断夹，缝合肌肉皮肤。假手术组同上操作，进线后不刺破血管。

1.3 siRNA侧脑室注射和RES腹腔注射 siRNA由上海锐博生物公司合成。5nmol siRNA溶于10μL生理盐水，建模前24h经侧脑室注射。麻醉后将大鼠固定于脑立体定位仪，定位前囟后5mm，中线旁开1.5mm，深度3.5mm，采用进样器缓慢推注。假手术组钻孔但不注射。TXNIP siRNA序列［10］：正义链5'-GCUGGAUAGACCUAAACAUTT-3'，反义链5'-AUGUUUAGGUCUAUCCAGCTT-3'；ControlsiRNA序列：sense 5'UUCUCCGAACGUGUCACGU 3'；antisense 5'ACGUGACACGUUCGGAGAA 3'。白藜芦醇（resveratrol，RES）是一种广泛存在于多种植物中的天然抗毒素，具有抗氧化、抗凋亡、抗炎等多种生物学功能，能够迅速的渗透血脑屏障［11，12］。研究发现RES能够明显抑制TXNIP mRNA及蛋白的表达［4］。实验中RES干预组采用建模后1h进行RES（Sigma，-20℃）腹腔注射，剂量30mg/kg［13］，RES对照组注射相同剂量生理盐水。

1.4行为学评分 参照SUGAWARA等［14］于术后24h进行行为学评分（每组12只），总分18分。评分项目包括：自主运动；四肢运动的对称性；前爪的伸展性；攀爬运动；肢体的本体感觉；触须反应。得分越低则神经功能缺失越严重。

1.5脑水肿参照HE等［15］以干湿重法测量术后24h脑水肿（每组6只），即水含量=（湿重-干重）/湿重×100%。各组大鼠取脑后直接称重（湿重），后用烤箱（105℃，24h）烘烤，随后称取干重。

1.6荧光共聚焦神经元定位SAH大鼠脑组织冰冻切片，以0.25%Triton破膜，37℃孵育20min，枸橼酸钠盐溶液修复，高火5min，低火15min。PBS清洗3×5min，山羊血清37℃封闭2h。滴加TXNIP （1：50，Abcam）和NEUN（1：100，Merck Milliore）一抗，4℃冰箱过夜。次日复温1h，PBS清洗3×5min，暗室滴加荧光二抗（北京中杉金桥），37℃孵育90min。滴加DAPI核染（碧云天，1：500），常温孵育5～8min，PBS清洗3×5min，甘油封片。Olympus共聚焦显微镜拍片。

1.7 TUNEL法检测细胞凋亡 TUNEL试剂盒购自罗氏公司，SAH大鼠脑组织石蜡切片常规脱蜡脱水，余下步骤同上。滴加DAPI核染前，按照说明书，滴加50μL TUNEL反应混合液，湿盒中37℃孵育1h。DAPI核染，甘油封片。Olympus荧光显微镜下选择视野拍片。

1.8 Western blot检测 TXNIP及相关蛋白表达建模后24h取穿刺右侧大脑半球脑组织，匀浆震荡裂解。凝胶电泳后转至PVDF膜，5%脱脂奶粉37℃摇床封闭2h，滴加一抗4℃冰箱过夜。次日复温30min，TBST洗膜3×5min，滴加二抗37℃孵育2h。TBST洗膜后Fusion显影（Fusion fx 7 Spectra，法国Vilber）。抗体稀释比例：TXNIP（1：500，Abcam），Caspase-3（1：1000，CST），p-ASK-1（1：1000，Sigma），β-actin（1：1000，欣博盛），HRP anti-rabbit （1：2000，欣博盛）。Fusion软件分析条带灰度值。

表1行为学评分及脑水肿评估

2　结果

2.1死亡率及行为学评分 11只大鼠因穿刺失败或出血量较少不计入实验分组。各组死亡率为：SAH组（21.95%，n=9）、Control siRNA组（29.41%，n=5）、TXNIP siRNA组（14.29%，n=2）、RES对照组（25.00%，n=4）、RES干预组（20.00%，n=3）。TXNIP siRNA及RES干预组死亡率较Control siRNA组和RES对照组均有所改善。实验结果表明，TXNIP siRNA及RES干预后大鼠行为学得分得到改善（表1，P＜0.001）。其中TXNIP siRNA组［13.0（12.0，13.8）；R=30.83］大鼠行为学评分高于Control-SiRNA组［11.0（10.0，12.8）；R=18.79］；RES干预组［12.5 （11.0，13.8）；R=27.42］大鼠行为学评分高于RES对照组［11.4（10.6，12.5）；R=19.03］。

2.2干预前后脑水肿变化 实验结果显示TXNIP siRNA和RES干预后分别与Control siRNA组及RES对照组对比大鼠脑水肿得到改善（表1，P＜0.05）；同时Control siRNA组与RES对照组对比无明显统计学差异（P＜0.05）。干预前后各组间脑干水肿分析差异不显著（P＞0.05）。

2.3免疫荧光检测 TXNIP在神经元定位 SAH大鼠脑组织做冰冻切片进行荧光染色，采用神经元标记物NEUN标记，Olympus荧光共聚焦下1200倍油镜拍片，显示TXNIP主要表达在大鼠神经元胞质（图1）。

图1 SAH大鼠脑组织切片进行TXNIP和神经元标记物NEUN双染，Olympus荧光共聚焦拍片（1200×）

2.4荧光TUNEL与TXNIP双标 SAH大鼠脑组织切片，采用荧光TUNEL与TXNIP双染。Olympus荧光显微镜拍片显示皮层区和海马区TXNIP与凋亡细胞存在共定位（图2）。

图2 SAH大鼠脑组织石蜡切片TUNEL、TXNIP双染，Olympus荧光显微镜观察拍片，皮层400×、海马区200×

2.5 SAH后TXNIP及下游凋亡蛋白72h内表达变化 Western blot结果显示与Sham组对比（0.476± 0.043），TXNIP在SAH后12h（0.729±0.548）开始升高（图3），72h仍维持在较高水平（1.509±0.071，F= 7.806，P＜0.05）。同时，p-ASK-1、Caspase-3的表达也出现增高（F=549.218，P＜0.05；F=719.592，P＜0.05）。

2.6干预后的表达情况见表3、4，图4、5。通过TXNIP siRNA进行干预，与Sham组相比（0.778± 0.015），SAH后TXNIP表达出现下调（0.362± 0.015，F=900.849，P＜0.05）。与Control siRNA组相比（2.664±0.104，0.599±0.049），TXNIP siRNA干预组p-ASK-1（2.417±0.066，F=32.897，P＜0.05），Caspase-3（0.439±0.030，F=89.120，P＜0.05）表达量均出现下调（P＜0.05），而Control siRNA组与SAH组对比无明显统计学差异（P＜0.05）。与RES干预对照组相比（1.264±0.022），RES干预后TXNIP表达量出现下调（1.062±0.015，F=263.481，P＜0.05）。与RES干预对照组相比（0.383±0.010，0.362±0.008），RES干预组p-ASK-1（2.417±0.066，F=535.737，P＜0.05）、Caspase-3（0.260±0.013，F=69.254，P＜0.05）表达量也出现下调，而RES干预对照组与SAH组对比无明显统计学差异（P＜0.05）。

表2 Western blot各时间点OD值变化趋势

3　讨论

近年研究表明EBI可能是临床SAH患者高致残率和致死率的首要原因。EBI指的是SAH后72h内整个脑组织发生的直接损害，包括脑组织细胞的死亡、血脑屏障的破坏（blood-brain barrier，BBB）破坏、脑水肿、急性脑血管痉挛、微血管功能障碍等［1］。课题组前期研究也证实减轻细胞凋亡能够改善SAH后EBI［16］。本实验则通过大鼠SAH模型，证实TXNIP在SAH在促进脑组织细胞凋亡的作用，阐明了TXNIP通过促凋亡作用参与SAH 后EBI发生的可能机制。

图3 SAH后各时间点TXNIP及下游蛋白表达变化

图4 siRNA干预后TXNIP及下游蛋白表达变化

图5 RES干预后TXNIP及下游蛋白表达变化

TXNIP也被称作硫氧还蛋白结合蛋白2（thioredoxin binding protein-2，TBP-2）、维生素D3上调蛋白1（vitamin-D3 upregulated protein-1，VDUP1），是体内TRX的天然拮抗剂。在病理状况下TXNIP可以绑定并抑制TRX活性，使正常情况下与TRX紧密结合的ASK-1解离，导致下游凋亡信号激活［6-8］。近年来其他研究也发现TXNIP参与到血栓性脑缺血、脑损伤过程中［4，5］。而TXNIP是否通过上述机理参与EBI的发生机制尚未见报道。

表3 TXNIP siRNA干预前后各蛋白Western blot OD值

表4 RES 干预前后各蛋白Western blot OD值

实验采用血管内穿刺法建立大鼠SAH模型。荧光共聚焦显示TXNIP主要表达在神经元胞质（图1），同时荧光TUNEL显示TXNIP与皮层和海马区凋亡细胞出现共定位（图2），证实TXNIP可能参与SAH后脑组织细胞凋亡发生。Western blot结果则提示SAH后早期TXNIP表达逐渐增高，在72h仍处于较高水平，下游凋亡相关因子p-ASK-1、Caspase-3也出现上调（图3）。与此同时，实验中分别对TXNIP进行siRNA敲低和腹腔注射TXNIP抑制剂。结果也证实TXNIP表达被下调，下调TXNIP表达后下游凋亡因子表达也被抑制（图4、图5）。同时干预后的大鼠行为学评分、脑水肿也得到改善（表1）。

细胞凋亡在EBI发生过程中具有重要地位。本实验从分子及形态学水平共同证实下调TXNIP的表达能够减轻SAH后减轻细胞凋亡发生，改善SAH脑组织损伤，阐明了TXNIP参与SAH早期细胞凋亡的可能机制，为此后的临床研究提供了较好的前期基础。实验中也存在不足之处：就目前的文献报道TXNIP的特异性抑制剂仍未发现，RES是文献中使用较多的TXNIP非特异性抑制剂，因此同时采用siRNA对TXNIP进行敲低，从基因层面进行补充说明；此外，TXNIP的表达调控机制近来的文献报道较多，在后期的实验中我们将会对TXNIP上游的调控及其促炎机制进行深入研究。

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（责任编辑：甘章平）

Downregulation of thioredoxin-interacting protein attenuates early brain injury after subarachnoid hem-orrhage of rats.

ZHAO Qing，CHE Xudong，TAN Guanping，ZHANG Hongxia，JIANG Dengzhi，SUN Xiaochuan，HE Zhaohui.Department of Neurosugery，the First Affiliated Hospital of Chongqing Medical University，1 Friendship Road，400016 Chongqing，China.Tel：023-89011151.

R651.1

A

10.3969/j.issn.1002-0152.2016.03.012
☆国家自然科学基金（编号：81371309）；重庆市科委自然科学基金（编号：cstc2012jjA0472）资助；国家临床重点专科建设项目经费资助（编号：财社［2011］170号）
*重庆医科大学附属第一医院神经外科（重庆400016）

（E-mail：geno_he@163.com）

2015-07-26）