心复康含药血清对心脏干细胞中缝隙连接蛋白43水平的影响

阚伯红　高　青　胡先同　王一婧　赵　岚　范英昌

(天津中医药大学第一附属医院针灸研究所　天津市针灸学重点实验室，天津　300381)



·基础研究·

心复康含药血清对心脏干细胞中缝隙连接蛋白43水平的影响

阚伯红高青1胡先同1王一婧1赵岚范英昌1

(天津中医药大学第一附属医院针灸研究所天津市针灸学重点实验室，天津300381)

〔摘要〕目的探讨心复康含药血清对心脏干细胞分化的促进作用。方法采用细胞免疫荧光方法对传代后心脏干细胞进行检测，采用实时荧光定量PCR和Western印迹分别检测心脏干细胞中缝隙连接蛋白(Cx43)mRNA和蛋白表达。结果5%心复康含药血清培养72 h后，心脏干细胞中Cx43的转录水平和蛋白表达水平明显提高(P<0.05)。结论心复康含药血清具有促进心脏干细胞分化的作用，有利于阐明心复康治疗心肌梗死的作用机制。

〔关键词〕心脏干细胞；心复康

急性心肌梗死(AMI)多数临床支持疗法着重于调节血流动力学、减低早期死亡率，但不利于心脏的修复和减少心力衰竭的发生。修复梗死心肌的最终目标是再生健康的、有功能的、可以和周围心肌细胞相整合的心肌组织，被普遍接受的治疗方法是通过增加组织再生促进愈合和抑制病理重塑〔1〕。心肌干细胞(CSCs)具有定向分化为心脏细胞的趋势，在AMI及缺血性心肌病的修复中发挥着重要作用。促进CSCs的增殖和分化对于心肌细胞再生的临床治疗是一个巨大挑战。本文通过检测心复康含药血清对CSCs中缝隙连接蛋白(Cx)43转录和表达的影响，阐明心复康对心肌分化的干预作用。

1材料与方法

1.1材料18s RNA(76 bp)上游引物：5′-CGAGCCGCCTGGATACC-3′，下游引物：5′-CCTCAGTTCCGAAAACCAACAA-3′；Cx43 NM_010288.3(101 bp)上游引物：5′-GATCGCGTGAAGGGAAGAAG-3′，下游引物：5′-CAGCCATTGAAGTAAGCATATT-TTG-3′。亲和素结合的兔抗大鼠/小鼠c-kit 抗体购自美国BD公司(1∶1 000)；兔抗大鼠/小鼠Cx43购自英国Santa公司(1∶1 000)；兔抗大鼠/小鼠/人甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)购自武汉博士德公司(1∶300)；异硫氰酸荧光素(FITC)标记的抗亲和素IgG购自Ligend(1∶1 000)，DMEM/DF12 培养液和胎牛血清(FCS)(澳洲源血清)购自GIBCO，重组人碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)购自美国invitrogen，Fasline Cell cDNA Kit(TIANGEN：KR105)，q-PCR 试剂盒(CW0662)和UltraSYBR Mixture购自北京康为世纪生物科技有限公司，0.45 μm聚偏氟乙烯(PVDF)膜购自美国Millipore，化学增强发光法(ECL)试剂盒购自索莱宝，荧光显微镜(Leca DM3000，德国)，实时荧光PCR 系统(RochLightCycle 480，瑞士)，生物分光光度计(EppendoBioPhotometer，德国)，SIGMA 3-18K 台式低温高速离心机(SIGMA，德国)，Q/TLY001 型电泳装置(北京市六一仪器厂，中国)，湿性转膜仪(GE，美国)，凝胶成像系统(Biorad，美国)。

1.2方法

1.2.1含药血清的制备参见文献〔2〕。

1.2.2CSCs的培养C57 小鼠CSCs由美国西北大学医学院芬伯格心血管研究所覃刚健教授惠赠。培养基成分〔3〕：DMEM/F12，10%澳洲源FCS，2 mmol/L 谷氨酰胺，0.1 mmol/L β巯基乙醇，1%非必需氨基酸，5 ng/ml bFGF。培养条件：37℃，5% CO2培养箱，隔天换液并传代。

1.2.3CSCs的免疫荧光鉴定CSCs消化分散后，接种于放好盖玻片的24孔培养板中，培养24 h，磷酸盐缓冲液(PBS)洗3次，每次洗10 min；换4%多聚甲醛固定15 min；再以PBS 洗3次，每次洗10 min；以镊子取出盖玻片贴于载玻片上；以封闭血清室温封闭1 h；PBS 洗3 次，每次洗10 min；以c-kit 一抗室温孵育2 h；PBS 洗3次，每次10 min；FITC 标记的二抗避光孵育1 h；PBS 洗3 次，每次洗10 min；二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)染液室温孵育5～10 min；PBS 洗3 次，每次洗10 min；滴加抗荧光淬灭封片液后封片；荧光显微镜下观察并采集图像；以PBS代替一抗，作为阴性对照。

1.2.4实验分组和干预分为空白血清组和含药血清组。细胞接种密度为1×105个/ml，CSCs基础培养液培养12 h，空白血清组在原培养液中加入5%兔空白血清，含药血清组在原培养液中加入5%含药血清，37℃，5% CO2培养72 h。

1.2.5荧光定量PCR检测Cx43 mRNA的表达量细胞cDNA快速制备参见试剂说明书，PCR 反应体系〔2×UltraSYBR Mixture(with ROX) 10 μl，10 μmol/L上、下游引物各1 μl，cDNA模板1 μl，RNase-Free水7 μl〕，PCR 反应条件：预变性 95℃，10 min，1个循环；延伸95℃、15 s，60℃、1 min，45个循环；溶解曲线分析95℃、15 s，60℃、1 min，97℃延伸，1个循环；cooling 40℃、30 s，1个循环。

1.2.6Western印迹法测定Cx43蛋白的表达量所提细胞总蛋白以二喹啉甲酸(BCA)法按试剂说明书测蛋白浓度，加入5倍上样缓冲液。100℃变性5 min，瞬时离心。10%聚丙烯酰胺凝胶垂直电泳。湿转250 mA稳流转膜2 h。将膜蛋白面朝上，按试剂说明书加入兔抗小鼠多克隆抗体Cx43(1∶1 000稀释)和GAPDH(1∶300稀释)各2 ml，密封于袋中，4℃过夜；室温平衡30 min，去除一抗，用Tris盐酸缓冲液(TBST)洗膜，5 min×3次；蛋白面朝上，按试剂说明书加入1∶4 000倍稀释的辣根过氧化物酶标记的兔抗山羊IgG抗体各2 ml，密封于保鲜袋中，37℃震荡1 h；去除二抗，用TBST洗PVDF膜，5 min×3次。按照试剂说明书配制发光液，与膜作用1 min，在凝胶成像系统采集图像，并对所得条带进行分析。

2结果

2.1CSCs免疫荧光鉴定结果以c-kit为一抗对CSCs进行标记，DAPI染核，发现虽经数次传代，但几乎所有细胞均具有c-kit表达，表明所培养细胞基因稳定，该培养条件适合CSCs培养，且能保持其干细胞潜能不变。见图1。

2.2心复康含药血清对CSCs中Cx43水平的影响经5%心复康含药血清培养72 h，心脏干细胞中Cx43的转录水平和蛋白表达水平明显提高(P<0.05)，见表1，图2。

A.绿色荧光为c-kit阳性细胞；B.DAPI染核的蓝色荧光与c-kit阳性细胞的绿色荧光的叠加图1　心脏干细胞免疫荧光鉴定(×200)

组别Cx43mRNACx43蛋白空白血清组(3.19E-06)±(7.04E-07)2.04±0.04含药血清组(1.15E-05)±(3.56E-06)1)5.16±0.171)

与空白血清组比较:1)P<0.05

图2　心复康含药血清对心脏干细胞中CX43蛋白表达的影响

3讨论

Cx43作为心肌闰盘结构中缝隙连接的主要结构蛋白，在细胞膜聚合形成的缝隙连接构成介导细胞离子、小分子和信号分子等的跨膜交流的重要结构基础，对于心肌细胞的发育、分化和收缩功能均有着重要作用，是心肌细胞分化的标志物。本研究发现心复康含药血清可明显提高CSCs中Cx43的转录和蛋白表达水平，具有促进心脏干细胞分化的作用。

c-kit阳性的CSCs 首先在大鼠心脏被鉴定，c-kit阳性是CSCs 最普遍特征，且这些细胞不表达骨髓细胞、神经细胞、骨骼肌细胞或心肌细胞的转录因子或膜和胞质蛋白，因此CSCs 不属于谱系细胞〔4〕。Lin(-)c-kit阳性 CSCs 具有干细胞的三大特性——能够自我修复、克隆性和多潜能，可以向心肌、平滑肌和内皮细胞方向分化。在缺血心肌中，这些细胞和他们的克隆后代分化成的心肌细胞和形成的血管可重组为具有年轻细胞特征的心肌，大约构成70%的心室组织。但当心肌大面积梗死时，相对有限的内源性CSCs很难及时修复受损心肌，因此，通过干预措施促进CSCs的增殖和分化变得至关重要。

CSCs的增殖分化受多种因素调节，诸如旁分泌或自分泌、生长因子和药物等。药物相对于其他方法更加简便、安全和有效。中药在CSCs分化中发挥重要作用，研究发现黄芪甲苷可以促进小鼠CSCs分化为心肌样细胞〔5〕。心复康具有益气活血的作用，能够明显改善AMI患者的临床症状〔6〕。体外研究表明心复康可有效增强心肌细胞抗缺氧性损伤的能力〔7〕。西洋参为心复康的君药，具有补气养血之功效，可减轻大鼠AMI后心室重构〔8〕。人参皂甙是西洋参中主要的有效成分，也是生理活性最显著的物质。有研究发现人参皂苷RG1能够明显增加神经干细胞的增殖〔9〕，增加环境依赖的骨髓干细胞在体外分化为内皮分化〔10〕。因此，心复康可能通过代谢后的单体成分发挥促CSCs分化的作用，其确切机制有待进一步研究。

4参考文献

1Wollert KC，Drexler H.Cell therapy for the treatment of coronary heart disease：a critical appraisal〔J〕.Nat Rev Cardiol，2010；7(4)：204-15.

2阚伯红，王一婧，胡先同，等.心复康含药血清对骨髓干细胞表达和分泌SDF-1α的影响〔J〕.国际生物医学工程杂志，2014；37(5)：275-8.

3Zhang LX，DeNicola M，Qin X，etal.Specific inhibition of HDAC4 in cardiac progenitor cells enhances myocardial repairs〔J〕.Am J Physiol Cell Physiol，2014；307(4)：C358-72.

4Beltrami AP，Barlucchi L，Torella D，etal.Adult cardiac stem cells are multipotent and support myocardial regeneration〔J〕.Cell，2003；114(6)：763-76.

5廖联明，郑友生，江敏，等.黄芪甲苷促进心肌干细胞分化的作用研究〔J〕.中华细胞与干细胞杂志(电子版)，2011；1(1)：52-6.

6胡丽辉，李茹茹，袁芳.心复康在治疗脑梗死合并慢性心功能不全的疗效观察〔J〕.中国当代医药，2009；16(16)：47-8.

7范英昌，陆融.心复康对体外培养乳鼠心肌细胞影响的实验研究〔J〕.中草药，1997；28(9)：545-7.

8刘蜜，王琛，王晓礽，等.西洋参茎叶总皂苷通过抑制内质网应激相关细胞凋亡减轻大鼠急性心肌梗死后心室重构〔J〕.中国病理生理杂志，2013；29(5)：796-803.

9He W，Wu WK，Wu YL，etal.Ginsenoside-Rg1 mediates microenvironment-dependent endothelial differentiation of human mesenchymal stem cells in vitro〔J〕.J Asian Nat Prod Res，2011；13(1)：1-11.

10Shen LH，Zhang JT.Culture of neural stem cells from cerebral cortex of rat embryo and effects of drugs on the proliferation ability of stem cells〔J〕.Acta Pharmaceutica Sinica，2003；38(10)：735-8.

〔2015-06-17修回〕

(编辑袁左鸣)

基金项目：国家自然科学基金资助项目(No.81173413)；天津市高等学校发展基金项目(No.20120211)；天津市中医药管理局中医、中西医结合科研专项课题(No.13079)

通讯作者：范英昌(1951-)，男，硕士，教授，博士生导师，主要从事中西医结合治疗心血管疾病研究。

〔中图分类号〕R542.2+2

〔文献标识码〕A

〔文章编号〕1005-9202(2016)12-2829-03；

doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.12.001

1天津中医药大学

第一作者：阚伯红(1978-)，女，博士，副主任医师，主要从事中西医结合治疗老年性相关疾病研究。