微粒与凝血

易晓榕综述，桂晓美，冯江审校

(1、南昌大学2015级研究生，江西　南昌330006；2、江西省人民医院检验科，江西　南昌330006；3、南昌大学公共卫生学院，江西南昌330006)



·综述·

微粒与凝血

易晓榕1综述，桂晓美2，冯江3审校

(1、南昌大学2015级研究生，江西南昌330006；2、江西省人民医院检验科，江西南昌330006；3、南昌大学公共卫生学院，江西南昌330006)

摘要：血栓性疾病严重威胁人类的生命健康，其发病率高居各种疾病之首，且近年来还有增加的趋势，这成为了当代医学研究的重点和热点之一。研究发现，微粒对血栓的形成发挥了重要的作用，血栓性疾病患者体内的微粒含量增多。微粒通过多种途径调节了与促凝相关的细胞因子，使机体处于高凝状态。微粒对于血栓性疾病有重要的预测价值，本文就微粒的研究进展综述如下。

关键词：血栓；微粒；研究进展

冯江，男，1959年7月生，教授，专业：临床检验诊断学。

随着科技进步，人们对微粒（microparticles，MPs）的认识不断提高。虽然目前MPs的产生过程还未被阐明，但人们普遍认为MPs是细胞活动和凋亡过程中通过细胞的胞吐作用产生的的微小囊泡，外膜为双层脂质。微粒携带了许多生物信息（表1），这些成分可参与人体的各项活动[1]，如近年来血小板源性微粒（PMPs）的抗炎作用，血小板中含有脂氧酶12（LOX12），PMPs从血小板上脱落下来也含有LOX12，而肥大细胞内含有丰富的白三烯，PMPs与肥大细胞融合可以催化产生脂氧素A4 （Lipoxin A4），Tang K等人由此发现了诱导产生脂氧素的新方法，这为抗炎研究打开了一扇新的大门[2]。总之，MPs的与临床疾病联系紧密，具有重要的诊断和预测价值。

许多疾病到了一定阶段会出现并发症，部分患者发展成为血栓性疾病[3，4]，从而增加患者的死亡率。其间，除了我们所熟知的凝血因子、血小板等发挥作用外，MPs也在其中发挥了重要作用。有研究[5]报道关于胰腺癌的静脉栓塞的试验，结果发现许多细胞表达的组织因子（TF）增多并且检测到了携带组织因子的微粒（TF-MPs）。

1　 MPs的产生

MPs可从血液、尿液等途径获得，MPs的直径大约是100~1000nm。虽然MPs的产生过程还未被阐明，但人们普遍认为MPs是细胞活动和凋亡过程中通过细胞的胞吐作用产生的一种小囊泡。原本细胞膜表面的磷脂是不对称分布，细胞释放MPs时，在爬行酶等的作用下，部分磷脂如磷脂酰丝氨酸（PS）由膜内转移至膜外，因此部分MPs表面携带了PS。人体内几乎所有细胞都可以产生MPs，但对血细胞源性MPs的研究最为充分，这些细胞包括血小板、白细胞、红细胞、巨噬细胞、内皮细胞、癌细胞等，血液中的MPs主要是由血小板释放的[6]，约占70%~90%，含有丰富的母体细胞的表面蛋白、脂质和胞质成分，如表面受体、细胞因子、磷脂、信使核糖核酸（mRNA）和小分子核苷酸（microRNA）。MPs的生命半周期平均约为5.8h[7]。

表1　MPs的作用

2　 MPs的促凝作用

MPs的促凝作用主要是通过TF、黏附分子、PS来发挥促凝作用。

2.1TF MPs表面可以表达TF。不同细胞来源的MPs表达的TF活性不同，如血小板源性微粒表达的TF活性较弱，而癌细胞源性微粒表达的TF活性较强。MPs表达的TF通过与凝血因子Ⅶ/活化凝血因子Ⅶa（FⅦ/FⅦa）结合而启动外源性凝血反应。MPs表面的TF含量不同，凝血的效果也不同，TF含量少的MPs所形成的血栓的重量、大小都低于TF含量多的MPs。

2.2黏附分子MPs可以表达黏附分子，从而使MPs与细胞相互作用、相互诱导，产生一系列的反应，使细胞表达更多的促凝物质，从而促进凝血反应。如内皮细胞源性的MPs可以表达P选择素糖蛋白配体（PSGL）、细胞间黏附分子（ICAM）等，与单核细胞表面的β2整合素相互作用，从而使单核细胞表面表达的TF增多，且单核细胞内的TF-mRNA也增多。

2.3PS MPs表面可以表达PS，PS是通过组装MPs表面依赖钙离子的凝血因子来促进凝血。当CaCl2浓度在4~6mM时，绝大部分PS暴露在膜外。PS可以选择性地结合FⅤ、FⅧ的C样结构域，为FⅤa、FⅧa和FⅩa的形成提供催化表面，促进凝血酶形成。PS还可以增强TF/FⅦa复合物的组装与催化活性，促进外源性凝血途径的发生。膜表面的PS有助于凝血复合物的形成以及促进TF诱导的凝血[8]，加速凝血反应。MPs表面的PS只能够加速凝血反应，并不能单独诱导凝血发生。

3　 MPs的抗凝功能

MPs除了有促凝作用外还有抗凝作用，如向心肌梗死小鼠注射MPs可以使心肌功能增强，心率（HR）、左心收缩压（LVSP）等增强[9]。这对人体正常运行具有重要意义。MPs的抗凝物质有组织因子途径抑制剂（TFPI）、纤维蛋白溶酶原、活化蛋白C （APC）。在正常健康人体内，这些物质会与促凝因子达到平衡，从而避免了凝血功能紊乱。

3.1组织因子途径抑制物TFPI通过调节TF-FⅦ复合物，从而避免了凝血紊乱[10]。表达TFPI的MPs主要是由内皮细胞[11]、单核细胞[12]、癌细胞[13]产生，循环MPs是由心肌梗死和糖尿病[14]患者产生的。所有MPs表面TFPI和TF的平衡影响了血栓形成，在不同的疾病阶段，TFPI和TF的比例不同。这种平衡不仅可以反应的患者是否处于高凝状态，还可以帮助判断血栓的危险程度[15]。

3.2纤溶酶原激活剂白细胞、内皮细胞、癌细胞源性微粒表面有尿激酶型纤溶酶原激活剂（u-PA）或者组织型纤溶酶源激活剂（t-PA），这些细胞在不同病理环境下可以发挥纤溶作用。t-PA结合纤维蛋白增加了MPs与纤维蛋白溶酶原的亲和力，u-PA活化纤维蛋白溶酶原使纤维蛋白溶酶原的分子组合变成纤维蛋白溶酶[16]。

3.3内皮细胞蛋白C受体（EPCR）当具有抗凝活性的APC与EPCR结合，通过血栓-血栓调节蛋白复合物提高了APC的活性[17]，从而灭活FVa、FⅧa因子，减少凝血酶的产生，从而发挥抗凝作用。

3.4含有ω-3多不饱和脂肪酸的二十五碳烯酸（EPA）据研究[18]表明，服用含有ω-3多不饱和脂肪酸的二十五碳烯酸（EPA）可以显著抑制血小板的聚集，降低PMPs的活性，延长凝血时间，但这些作用在男性中更加明显。

4　不同来源的MPs的功能

不同来源的MPs表面表达的促凝物质的种类和活性各不相同，在促进血栓形成过程中发挥作用的方式也不同，人们认为MPs通过以下几种方式与细胞相互作用，从而促进凝血反应：⑴与靶细胞表面配体结合，从而使蛋白质重新分布；⑵通过结合到靶细胞膜获得新的抗原，从而呈现一种新的特点；⑶通过细胞外环境的调节与靶细胞相互作用，如调节局部氧压；⑷通过融合内化来影响基因调节[19，20]。

4.1血小板源性的MPs（PMPs）据报道，PMPs在健康人群中的含量最多，大约有70%~90%。PMPs表面的促凝受体比血小板多很多，促凝活性是血小板的100倍。PMPs表面的信号分子包括miRNA、生长因子、有丝分裂原等，通过这些信号分子，PMPs可以介导细胞之间的相互作用，调节细胞的功能活性。PMPs被认为是具有生物活性的血管感受器，是促凝磷脂的储蓄池，是调节止血平衡的重要物质。PMPs在血栓形成部位大量聚集，促进血栓形成的机制可能是：⑴表达在PMPs外膜的PS可以结合FⅡa、FⅤa、FⅧ、FⅨa，为凝血酶的形成提供催化表面，加速凝血酶的形成；⑵PMPs表面表达糖蛋白受体GPⅡb/Ⅲa可以与纤维蛋白原、血管性血友病因子（vWF）、纤维连接蛋白以及胶原结合，形成纤维蛋白网；⑶血小板释放PMPs时，使PMPs携带了血小板活化因子（PAF），当PMPs被激活时，PAF激活血小板发挥促凝作用；⑷PMPs表面表达TF，它可以与FⅦa结合，活化FⅩ，启动外源性凝血途径，从而触发凝血反应；⑸PMPs与细胞间也可以相互作用，如PMPs与单核细胞相互作用，可以增加单核细胞表面表达TF。增加PMPs的含量可以促进血小板的黏附和聚集，增强凝血因子的活性，从而促进血栓形成。在血管疾病和血小板聚集活动中，循环PMPs的含量显著增加。血栓病人体内PMPs的增加可能是因为血小板极易被激活，从而产生较多的PMPs。冰冻储存的血小板血浆在一定时间范围内可以表达大量的TF和PS，但若是储存时间过长TF和PS含量反而会减少[21]。急性冠状动脉综合征患者的冠状动脉处的PMPs含量比外周血中PMPs多，这些PMPs增加了血小板的活性，使血小板相互聚集，PMPs表面的TF、PS等也发挥作用，从而促使血栓形成[22]。

4.2白细胞源性MPs（LMPs）LMPs在内皮细胞中既可以提高内皮细胞功能，又可以诱导内皮细胞功能丧失，在这过程中LMPs调整内皮细胞功能，增加炎性细胞在血管壁聚集，损伤内皮细胞，这一过程对于动脉粥样硬化形成过程很重要，LMPs参与了动脉粥样硬化形成的所有阶段。LMPs还参与了促凝、血小板活化、血管形成。

4.2.1单核细胞源性的MPs（MoMPs）从单核细胞悬液中提取的MoMPs表面共同表达了促凝的TF和凝血酶调节蛋白，也表达黏附分子如CD15或者P选择素糖蛋白配体（PSGL-1），通过结合P选择素减少激活的血小板，从而导致在血栓和纤维蛋白形成过程中TF的聚集。从脑膜炎球菌、镰刀形贫血症患者体内获得的单核细胞表达TF，HIV患者血液中的单核细胞表面还可以表达大量的TF[23]。源于人类急性单核细胞白血病细胞系（THP-1）的单核细胞可以表达CD15，它可以调节MoMPs与活化血小板上P选择素的结合，在凝血酶内通过PSGL-1途径，MoMPs可以被活化的血小板捕获，从而使TF聚集以及加剧了纤维蛋白的沉积。Maria Letizia等人的研究表明，凋亡单核细胞源性的MPs可以通过减少小窝蛋白的含量以及提高小窝蛋白磷酸化水平，增强对内皮细胞的硝化作用，损伤内皮细胞，引发了凝血反应。

4.2.2中性粒细胞源性MPs（NMPs）在低氧环境中，由中性粒细胞源释放的表达TF或PS增多，带负电荷的PS可以和FV、FVIII、FX形成凝血复合物，加剧了体内的凝血反应。根据Chen YC等人的试验表明在高氧环境中锻炼可以减缓中性粒细胞源性的MPs的释放，以及减少其表面表达的PS和/或TF的表达，这对于机体抗凝有重要意义[24]。NMPs包含巨细胞抗原1（αMβ2），调节与其余血小板相互作用的，血小板被激活，表面的P选择素表达增加以及血栓形成。另外，表达αMβ2的NMPs与尿激酶、纤溶酶原和金属基质蛋白酶-2和-5相互作用，表明NMPs可以在纤维蛋白溶解和组织重构中发挥作用。

4.2.3淋巴细胞源性MPs淋巴细胞源性的MPs包括T细胞源性微粒（TMPs）、B细胞源性微粒（BMPs）、自然杀伤细胞源性微粒（NMPs）。携带Fas配体（FasL）的TMPs通过Fas-FasL途径与平滑肌细胞相互作用，激活了NFκB，增加了NO合成酶和环氧合酶-2的表达，损伤内皮细胞，引起凝血反应。

4.3红细胞源性微粒人们对红细胞源性微粒关注较少。由于红细胞的流变学特性，这些红细胞源性的微粒可以进入细胞内部[25]，从而增加它们与血红蛋白和氮氧化物的相互作用以及使内皮细胞功能障碍，损坏内皮细胞，从而引发凝血。红细胞源性微粒可以预测血栓进展。

4.4巨噬细胞源性MPs来源于动脉血管壁内聚集的单核细胞，在刺激动脉粥样硬化方面巨噬细胞源性的MPs是最主要的。动脉粥样硬化处巨噬细胞源性的MPs可以表达CD40配体（CD40L），促进内皮细胞增生。它们还可以促进纤维帽内淋巴细胞活性和血管生成。

4.5内皮细胞源性MPs（EMPs）当内皮细胞受损或炎症调节因子破坏内皮细胞时，EMPs就会被释放出来。从某一个方面来说EMPs是连接凝血与炎症的桥梁。EMPs表面呈现不同的抗原，如TF、凝血酶调节蛋白（TM）、内皮细胞蛋白C受体（EPCR），当机体处于凝血状态时，EMPs会上调表达TF，而下调TM和EPCR。许多研究表明，心血管疾病患者体内的EMPs含量较多，如在动脉栓塞患者，不稳定斑块处的EMPs含量比稳定斑块处的多。EMPs可以促进或抑制血管产生，它发挥哪种功能，这取决于刺激物的作用，如凝血酶通过增加TRAIL/TRAIL-R2的表达，从而使内皮细胞释放EMPs，从而促进凝血反应。

4.6癌细胞源性MPs癌细胞也可以释放MPs，人类不同起源的癌细胞表达了不同水平的TF。这些MPs也表达PSGL1，还可以激活凝血因子，以及诱导血小板聚集。据报道，癌细胞可以促进血栓的形成，而向小鼠体内注射富含TF的癌细胞源性的MPs，形成的血栓大小和重量与直接注射癌细胞相同。癌症患者中TF-MPs的含量与由D二聚体含量所决定的凝血因子的活性有关[26]。

许多癌症患者会采用化学治疗，杀死癌细胞的同时，也损伤了体内的细胞，这也会加剧血栓的形成[27，28]。服用具有细胞毒性的药物会增加TF的活性以及使MPs表面暴露更多的PS。在化学治疗过程中主要是由内皮细胞和白血病细胞释放含有PS或者TF活性的MPs的[29，30]。因此治疗癌症不仅要去除癌细胞，还要防止其他并发症的危害。化学疗法最大的障碍是药物抵抗（MDR），通过转运P选择素糖蛋白（P-gp）和mRNA到癌细胞源性的MPs，MPs可以在癌细胞间传播MDR[31，32]。

5　 MPs的检测

检测MPs最常用的方法是流式细胞仪检测技术，流式细胞仪利用MPs的大小将MPs与其它外泌体区分开来。但由于MPs分子直径（100~ 1000nm）变化较大，以及流式细胞仪自身的局限性，一部分较小的MPs无法被检测到，最终会导致结果出现偏差。经过人们的不断探索，人们发现利用MPs表面暴露PS这一特性和Annexin V与PS的高亲和性，用包被Annexin V的磁珠来捕获MPs，再用流式细胞仪分析，这样也可以检测出MPs的含量。利用包被Annexin V的磁珠捕获TFMPs这一方法的灵敏度、特异度比单纯使用流式细胞仪更高[33]。这一方法也存在缺陷，并非所有的MPs都表达PS，所以仍然不能检测到部分的MPs。还有一种利用抗PS抗体的荧光检测技术与用包被Annexin V的磁珠捕获MP的原理一样，是利用抗原抗体反应来检测。

仅仅使用流式细胞仪只能分离出MPs，但不能确定MPs的来源。若想要确定MPs的细胞起源，就要加入相应的荧光抗体，通过荧光分析来确定MPs的来源。根据不同起源细胞起源的MPs表面标记物不同（表2），如血小板源性的MPs表面标记物是CD41和Annexin V，根据MPs大小和表面标记物，可以更准确地检测出不同来源的MPs。

6　总结

MPs是细胞活动或凋亡过程中产生的囊泡，它不仅在疾病状态时可以检测到，在健康正常人体内也可以检测到。Berckman等人发现在健康正常人体内这些循环的MPs含量较少，只是参与了低程度的血栓产生。由于MPs的产生过程以及测量金标准都还未被发现，我们仍然需要不断探索，它对于预测疾病有重要的价值。MPs不仅仅有促进凝血的功能，还有抑制凝血的功能，当促凝作用大于抗凝作用时，机体出现血栓；当抗凝作用大于促凝作用时，就会抑制血栓的出现。针对不同的疾病情况，使MPs发挥不同的功能，这是一个非常值得探索的问题。

表2　不同白细胞来源的MPs表面标记物

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中图分类号：R364.1+5

文献标识码：A

文章编号：1674-1129(2016)03-0322-05

DOI：10.3969/j.issn.1674-1129.2016.03.019

基金项目：江西省教育厅科技落地计划项目（编号：KJLD12013）

作者简介：易晓榕，女，1993年3月生，医学学士学位，专业：临床检验诊断学，研究方向：凝血。

通信作者：桂晓美，女，1963年10月生，主任技师，专业：临床检验诊断学，研究方向：老年疾病及代谢性疾病的生化检测。

(收稿日期2016-01-21；修回日期2016-05-16)