miRNA - 374a在狼疮肾炎患者血清中的表达及其意义

张运津，章桂娇，徐青青，吴虹，葛秀华，钟小兰

(南昌三三四医院肾内科，江西　南昌330024)



·论著·

miRNA - 374a在狼疮肾炎患者血清中的表达及其意义

张运津，章桂娇，徐青青，吴虹，葛秀华，钟小兰

(南昌三三四医院肾内科，江西南昌330024)

摘要：目的探讨狼疮肾炎患者血清miRNA-374a的表达情况及其意义。方法运用TargetScan靶基因预测分析软件等生物信息学方法，预测miRNA-374a靶基因并进行分析；采用qRT-PCR方法检测miRNA-374a、MCP-1在狼疮肾炎患者血清和健康对照组血清的表达变化，并分析其与临床参数的关系。结果生物信息学分析显示MCP-1为狼疮肾炎的靶基因；与健康对照组相比，miRNA-374a在狼疮肾炎患者血清低表达(P<0.05)，MCP-1在狼疮肾炎患者血清高表达(P<0.05)；miRNA-374a、MCP-1的表达水平与年龄没有明显关系(P>0.05)，与临床分期有关(P<0.05)。结论miRNA-374a在狼疮肾炎患者血清中低表达，可能通过对其下游靶基因MCP-1的调控，在狼疮肾炎发生过程中发挥作用。

关键词：miRNA-374a；MCP-1；狼疮肾炎；实时定量PCR

狼疮肾炎(lupus nephritis，LN)是系统性红斑狼疮最重要的脏器损害和主要死亡原因之一。miRNA是天然的基因调控因子，它在细胞分化、血管形成、胚胎发育、肿瘤发生等病理生理过程中发挥重要的调控作用[1]。研究表明差异表达的miRNA与很多疾病的发生发展有密切关系[2-7]，miRNA有望成为早期的诊断标志物和潜在的治疗靶点。目前，miRNA-374a在LN的研究情况尚未见报道。本课题拟通过对miRNA-374a进行生物信息学分析预测其靶基因，检测miRNA-374a及其靶基因MCP-1在LN患者血清中的表达变化，并分析其与临床参数的关系，旨在探讨miRNA-374a在LN发生发展过程中的可能作用。

1　材料与方法

1.1研究对象所有研究对象均为南昌三三四医院住院和门诊患者。LN诊断标准：确诊为系统性红斑狼疮的患者，具备下述4项标准中3项：⑴持续蛋白尿为2～4+；⑵血浆中白蛋白≤35g/L；⑶尿液中见红细胞、颗粒或蜡样管型；⑷尿液镜检红细胞5/HPF。排除标准：⑴除外各种混合性结缔组织病；⑵除外心、脑、肾、肝及造血系统等严重原发性疾病；⑶排除精神病、内分泌代谢病及妊娠期妇女。收集其血清标本共计18例，均为女性；年龄35～72岁，平均56.8岁；根据静止期和活动期分为两组：LN活动性肾损害组7例，LN非活动性肾损害组11例，另选15例健康体检的正常女性血清作为健康对照组。

1.2主要仪器与试剂德国Biometra Tpersonal PCR仪，美国ABI实时定量PCR仪step one plus。北京天根生化科技有限公司的miRcute miRNA提取分离试剂盒、miRcute miRNA cDNA合成试剂盒、miRcute miRNA荧光定量PCR试剂盒，Fermentas的逆转录试剂盒，北京全式金生物技术有限公司的2×EsyTaq PCR SuperMix试剂盒。

1.3方法

1.3.1qRT-PCR检测miRNA-374a、MCP-1的表达按试剂盒说明书操作。分别以U6和GAPDH为miRNA-374a和MCP-1的内参。miRNA-374a下游引物是试剂盒的通用引物，其余引物序列及PCR产物片断大小见表1。采用2-△△CT法进行数据分析。

表1　PCR引物序列

1.3.2生物信息学预测miRNA-374a的靶基因利用TargetScan（http://www.targetscan.org）、PicTar（http: //pictar.mdc-berlin.de）、miRanda（http://www.microrna.org）、miRDB (http://mirdb.org)4个软件在线预测miRNA-374a的靶基因。

1.3.3统计学分析实验数据用中位数和四分位数间距[M(P25，P75)]表示，采用GraphPad Prism 5软件进行统计学分析。两样本比较采用非参数Mann-Whitney检验，P<0.05为有统计学意义。

2　结果

2.1miRNA-374a的靶基因预测TargetScan预测miRNA-374a靶基因为179个，miRanda预测为7557个，miRDB预测为677个，PicTar预测为125个。预测结果显示miRNA-374a调节的靶基因范围非常广泛。MCP-1是其中之一。

2.2miRNA-374a、MCP-1在两组血清中的表达情况qRT-PCR显示miRNA-374a在LN组的表达明显低于健康对照组，差异有统计学意义(P＜0.05)。见图1。MCP-1在LN组的表达高于健康对照组，差异有统计学意义(P＜0.05)。见图2。

图1　两组血清标本miRNA-374a表达比较

图2　两组血清标本MCP-1表达比较

2.3miRNA-374a、MCP-1的表达与LN临床参数间的关系miRNA-374a、MCP-1的表达水平与年龄没有明显关系(P>0.05)。但均与临床分期有关(P＜0.05)。见表2。表2 miRNA-374a、MCP-1的表达与LN临床参数间的关系

注：*P＜0.05。

3　讨论

miRNA-374a位于人染色体Xq13.2，目前研究较少仅有少量文献报道，具体功能尚不明确。Vosa U等[8]研究表明，与正常组织相比，在非小细胞肺癌的癌组织中miRNA-374a低表达，低表达的miRNA-374a在非小细胞肺癌的早期阶段可以作为患者危险分层和预后标记，可能是一个有前途的治疗肺癌的治疗目标。田瑞等[9]通过高通量基因芯片测得并经荧光定量PCR证实miRNA-374a在乳腺癌中的表达水平明显低于正常乳腺组织，且在低侵袭转移性乳腺癌中的表达量明显高于高侵袭转移性乳腺癌，提示miRNA-374a在乳腺癌中可能发挥着抑制肿瘤转移的作用。该团队[10]还证明miRNA-374a与乳腺癌的预后有关。Cai J等[11]则通过体内体外实验表明，miRNA-374a的高表达通过Wnt/β-catenin途径促进的EMT的发生及侵袭转移。

本研究利用qRT-PCR方法检测miRNA-374a 在LN患者血清和健康对照组血清的表达情况，发现miRNA-374a在LN患者血清中低表达，提示miRNA-374a可能在LN发生过程中起着重要作用。低表达的miRNA-374a与年龄没有明显关系，但与临床分期有关，说明下调的miRNA-374a与狼疮肾炎的疾病活动情况密切相关。

靶基因预测分析的结果显示miRNA-374a调节的靶基因范围非常广泛，涉及细胞增殖、细胞分化、细胞凋亡、信号转导及免疫调节等各个方面。单核细胞趋化蛋白-1 (monocyte chemoattractant protein-1，MCP-1)是其中之一。MCP-1又称单核细胞趋化激活因子(monocyte chemoattractant activating factor，MCAF)是趋化因子CC亚家族的一员。MCP-1基因位于17号染色体，含有三个外显子，两个内含子，其cDNA的开放阅读框架含有297个碱基编码MCP-1蛋白。MCP-1可由多种细胞合成和分泌，其中主要是单核细胞、巨噬细胞、内皮细胞，肾组织内的系膜细胞也可合成和分泌。

研究发现，MCP-1是LN炎症细胞浸润肾脏的信号，介导了炎症细胞的迁移、募集及组织的损伤，促进肾小球新月体形成和肾间质的损害[12]。Dai 等[13]采用免疫组织化学的方法，对18例肾活检为LN的女性患者的MCP-1蛋白和细胞进行定位，结果发现LN患者肾组织中MCP-1蛋白分布广泛，16例在肾小管表皮细胞的基底侧，9例在间质血管壁，CD68+，CD4+和CD8+细胞大量聚集。肾小管MCP-1的表达与CD68+细胞聚集的量以及肾间质纤维化程度关系密切。刘中娟等[14]应用ELISA和RT-PCR方法测定112例SLE患者、30例类风湿性关节炎患者、11例非SLE肾损伤患者及40例正常健康者血清MCP-1水平、外周血单个核细胞（PBMCs）MCP-1 mRNA水平；结果表明狼疮肾炎活动组患者PBMCs MCP-1 mRNA水平表达增加最为显著，MCP-1血清水平也较非活动组及正常对照组明显升高。说明上调的MCP-1与狼疮肾炎的疾病活动情况密切相关。陈泉池等[15]通过靶基因预测、双荧光素酶实验及Western blot实验等研究证实，miRNA-374a可能通过其靶基因MCP-1发挥抑制乳腺癌细胞增殖、转移的作用。

本研究结果表明MCP-1在LN患者血清中高表达，活动性肾损害组MCP-1血清水平较非活动性肾损害组明显升高。说明高表达的MCP-1与狼疮肾炎的疾病活动情况有关。

综上所述，推测在LN中，低表达的miRNA-374a可能通过对其靶基因调节来发挥作用，从而参与LN的发生发展。具体机制尚需细胞学实验进一步证实。

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中图分类号：R593.24+2，R522

文献标识码：A

文章编号：1674-1129(2016)03-0274-03

DOI：10.3969/j.issn.1674-1129.2016.03.005

基金项目：江西省卫计委基金资助项目（编号：20154011）

作者简介：张运津，男，1970年5月生，学士学位，副主任医师。主要从事肾内科工作。

(收稿日期2016-02-18；修回日期2016-03-25)

Expression and significance of serum miRNA - 374a in patients with lupus nephritis

ZHANG Yunjin，ZHANG Guijiao，XU qingqing，et al. Department of Nephrology，Nanchang 334 Hospital，Nanchang 330024，China.

Abstract：Objective To investigate serum miRNA-374a expression in patients with lupus nephritis and its clinical significance. Methods Target genes of miRNA-374a were predicted by bioinformatics methods such as TargetScan and closely related gene with lupus nephritis were screened. The expression levels of serum miRNA-374a and MCP-1 in patients with lupus nephritis and healthy controls were detected using qRT-PCR，and the correlations between those and clinical parameters were analyzed. Results Bioinformatics analysis revealed that of miRNA-374a target genes was MCP-1 in lupus nephritis. Compared with healthy controls，serum miRNA-374a was significantly lowly expressed in patients with lupus nephritis while MCP-1 was significantly highly expressed(P<0.05)；expression levels of miRNA-374a and MCP-1 showed no significant correlation with age(P>0.05)，but with clinical stages (P<0.05). Conclusion Low expression of miRNA-374a was detected in the serum of patients with lupus nephritis. It may play an important role in the pathogenesis and progression of lupus nephritis by regulating the downstream target gene MCP-1.

Key words:miRNA-374a；MCP-1；Lupus nephritis；Quantitative real-time PCR