雷公藤内酯醇抑制小鼠肾小球系膜细胞表达CXCL10的实验研究

施栋梁，祝先进，林秋萍，黄丽华，宋艳芳，林青

(1、福建中医药大学，福建　福州350108；2、福建医科大学附属协和医院检验科，福建　福州350001；3、福建中医药大学附属人民医院检验科，福建　福州350004)



·论著·

雷公藤内酯醇抑制小鼠肾小球系膜细胞表达CXCL10的实验研究

施栋梁1，祝先进2，林秋萍1，黄丽华3，宋艳芳3，林青3

(1、福建中医药大学，福建福州350108；2、福建医科大学附属协和医院检验科，福建福州350001；3、福建中医药大学附属人民医院检验科，福建福州350004)

摘要：目的探讨雷公藤内酯醇（triptolide，TPL）对γ干扰素（interferon-γ，IFN-γ）诱导的小鼠肾小球系膜细胞（SV40MES13）表达趋化因子CXCL10 mRNA的影响及其可能机制。方法将对数生长期SV40MES13随机分为空白组、刺激组、干预组，用不同浓度的IFN-γ（0U/ml～2000U/ml）刺激细胞不同时间（0h～48h）后，观察细胞表达CXCL10 mRNA的变化；用CCK-8法检测不同浓度（2ng/ml～20ng/ml）TPL对SV40MES13生存率的影响，选用细胞生存率大于90%的TPL用于后续实验，观察TPL对SV40MES13表达CXCL10 mRNA的影响；选用JAK/STAT信号通路特异性抑制剂AG490干预细胞，探讨IFN-γ是否通过JAK/STAT信号通路诱导CXCL10表达；收集以上细胞，用Real-Time PCR技术检测各组CXCL10 mRNA表达水平。结果IFN-γ能诱导SV40MES13表达CXCL10 mRNA，并呈时间、剂量依赖性；AG490具有抑制IFN-γ诱导的SV40MES13表达CXCL10 mRNA；TPL具有抑制IFN-γ诱导的SV40MES13表达CXCL10 mRNA的作用。结论IFN-γ可能通过激活JAK/STAT信号通路，诱导SV40MES13表达CXCL10 mRNA；TPL具有抑制IFN-γ诱导的SV40MES13表达CXCL10的作用。

关键词：雷公藤内酯醇；IFN-γ；肾小球系膜细胞；CXCL10；JAK/STAT

狼疮肾炎（lupus nephritis，LN）是指系统性红斑狼疮（systemic lupus erythematosus，SLE）合并双肾不同程度免疫性损害，同时具有明显肾功能损伤的一种自身免疫性疾病[1]。在肾组织活检中几乎所有SLE患者都有不同程度的肾脏受累，其中约有60%的SLE患者可发展为LN，约有5%～20%的LN患者在10年内可发展为终末期肾脏病，最终导致患者死亡[2]。

趋化因子作为介导炎症与免疫反应的桥梁，参与了多种肾脏疾病的发生发展过程[3]。CXC趋化因子配体10（Chemokine (C-X-C motif) ligand 10，CXCL10），又称为γ干扰素诱导蛋白10（interferon-γ-inducible protein 10，IP-10)，是高效的淋巴细胞趋化剂，具有激活和趋化CD4+T细胞，促进T细胞迁移至炎症组织中的作用[4]。既往的研究表明CXCL10在LN患者的肾组织、血清、尿液中异常表达，参与了LN的发生发展[5]。雷公藤内酯醇（triptolide，TPL）是雷公藤的主要活性成分之一，具有抗炎、免疫抑制、抗肿瘤等多种药理作用，在临床上广泛用于炎症性疾病和自身免疫性疾病的治疗中[6]。本课题以小鼠肾小球系膜细胞（SV40MES13）为研究对象，探讨IFN-γ是否能诱导SV40MES13表达趋化因子CXCL10，并应用JAK/STAT信号通路特异性抑制剂AG490、TPL对SV40MES13进行干预，了解AG490、TPL对CXCL10表达的影响，初步探讨IFN-γ、TPL调控SV40MES13表达CXCL10的机制。

1　材料与方法

1.1材料小鼠肾小球系膜细胞（SV40MES13）购自中国科学院上海细胞库；胎牛血清购自杭州四季青公司；EMEM-F12培养基、胰蛋白酶、PBS购自美国HyClone公司；雷公藤内酯醇由福建医科大学药学院林友文教授赠予，纯度大于99.48%；二甲基亚砜购自美国Sigma公司；CCK-8试剂购自日本同仁公司；重组小鼠IFN-γ、AG490购自美国R＆D公司；总RNA提取试剂盒、逆转录试剂盒、实时荧光定量检测试剂盒购自美国Promega公司；趋化因子CXCL10、GAPDH上下游引物均由上海英潍捷基公司提供。

1.2细胞培养SV40MES13培养在含有5%胎牛血清的DMEM-F12培养基中，放置于37℃，5%CO2培养箱中。种6孔板时，调整细胞浓度为1.0×105/ ml用于实验，种96孔板时，调整细胞浓度为4.0× 104/ml用于实验。待细胞生长至70%～80%融合时，更换无胎牛血清的DMEM-F12培养基饥饿处理12h后用于后续实验。

1.3IFN-γ诱导实验SV40MES13饥饿处理后，分别加入不同浓度IFN-γ（0U/ml、100U/ml、500U/ml、750U/ml、1000U/ml、1500U/ml、2000U/ml）于DMEM -F12培养基中，刺激24h后收集细胞备用；SV40MES13饥饿处理后，加入最适浓度的IFN-γ于DMEM-12培养液中，分别刺激不同时间（0h、6h、12h、24h、48h）后，收集细胞备用。

1.4AG490干预实验将饥饿处理后的SV40MES 13随机分成3组：空白组（不添加任何刺激）、刺激组（1000U/ml的IFN-γ刺激）、干预组（20μmol/ml 的AG490干预细胞2h后加入1000U/ml的IFN-γ共培养），24h后收集细胞备用。

1.5雷公藤内酯醇干预实验SV40MES13饥饿处理后，用不同浓度TPL（2ng/ml、4ng/ml、8ng/ml、10ng/ml、12.5ng/ml、15ng/ml、20ng/ml）与SV40MES 13共培养24h后加入10μl CCK-8（Cell Counting Kit-8）试剂，孵育1h后用酶标仪测出OD值，计算不同浓度TPL对于SV40MES13生存率的影响，选用适宜浓度的TPL用于后续实验；将饥饿处理后的SV40MES13随机分成3组：空白组（不添加任何刺激）、刺激组（1000U/ml的IFN-γ刺激）、干预组(不同浓度的TPL干预细胞2h后加入1000U/ml 的IFN-γ共培养），24h后收集细胞备用。

1.6Real-Time PCR检测CXCL10 mRNA的表达收集以上细胞，用RNA提取试剂盒提取细胞总mRNA，逆转录为cDNA，通过实时荧光定量PCR仪进行荧光定量PCR实验。反应条件为：95℃2min，1个循环；95℃15s，60℃1min，40个循环。以管家基因GAPDH作为内参照校正，用2-△△Ct计算每个样本mRNA相对表达量，引物序列见表1。

表1　Real-Time PCR引物序列

1.7统计学处理应用SPSS 22.0进行统计学分析，实验数据采用均数±标准差（x±s）表示。两组间均数的比较用t检验，多组间均数的比较用单因素方差分析，P＜0.05为差异具有统计学意义。

2　结果

2.1不同浓度IFN-γ对SV40MES13表达CXCL10 mRNA的影响应用不同浓度IFN -γ刺激SV40MES13后发现，低浓度IFN-γ即可诱导SV40MES13表达CXCL10 mRNA，随着IFN-γ浓度的不断增加，CXCL10 mRNA表达量也不断增加。当IFN-γ浓度为1000U/ml时，CXCL10 mRNA表达量是空白组的72.35倍（F=96.78，P＜0.01），此后，随着IFN-γ浓度的增加，CXCL10 mRNA表达进入平台期（图1）。

2.2IFN-γ作用不同时间对SV40MES13表达CXCL10 mRNA的影响应用1000U/ml的IFN-γ刺激SV40MES13不同时间后发现，6h时CXCL10 mRNA的表达水平即开始升高，24h时CXCL10 mRNA表达量是空白组的58.91倍（F=111.25，P＜0.01)，并达到最高峰，在48h时CXCL10 mRNA表达下降（图2）。

图1　不同浓度IFN-γ对CXCL10 mRNA表达的影响

图2　1000U/ml IFN-γ作用不同时间对CXCL10 mRNA表达的影响

2.3AG490对IFN-γ诱导的SV40MES13表达CXCL10 mRNA的影响应用JAK/STAT信号通路特异性抑制剂AG490干预SV40MES13后发现，AG490具有抑制IFN-γ诱导的CXCL10 mRNA表达的作用，与刺激组相比，抑制率为78.40%，差异具有统计学意义（tCXCl10=5.39，P＜0.01），见图3。

2.4雷公藤内酯醇对SV40MES13生存率的影响用不同浓度的TPL与SV40MES13共培养24h，我们选用细胞生存率大于90%时的TPL浓度（2ng/ ml、4 ng/ml、8ng/ml）用于后续试验中（表2）。

表2　TPL对SV40MES13细胞生存率的影响

2.5雷公藤内酯醇对IFN-γ诱导的SV40MES13表达CXCL10 mRNA的影响应用不同浓度TPL干预SV40MES13后发现，TPL具有抑制IFN-γ诱导的CXCL10 mRNA表达的作用，且抑制效果呈剂量依赖性。与刺激组相比，2ng/ml的TPL就能抑制CXCL10 mRNA的表达，抑制率为45.4%（F= 64.72，P＜0.01）；4ng/ml的TPL对CXCL10 mRNA的抑制率为65.4%（F=64.72，P＜0.01）；8ng/ml的TPL对CXCL10 mRNA的抑制率为89.76%（F= 64.72，P＜0.01），见图4。

图3　AG490及TPL对CXCL10 mRNA表达的影响

图4　不同浓度TPL对CXCL10 mRNA表达的影响

3　讨论

CXCL10属于CXC类趋化因子，是高效的淋巴细胞趋化剂，具有激活与趋化CD4+T淋巴细胞、NK细胞等作用[7]。研究表明，LN患者肾组织、血清、尿液中可见大量的CXCL10表达[5]；通过基因芯片分析MRL/lpr狼疮肾炎小鼠可见CXCL10表达上调[8]；前期研究也发现肾小管上皮细胞在受到IFN-γ的刺激后，CXCL10 mRNA及蛋白表达明显增加[9]；同时有学者称CXCL10在LN的辅助性诊断中具有100%的敏感性以及98%的特异性，可作为LN辅助性诊断的实验室指标[10，11]，可见CXCL10 在LN发生发展中具有重要作用。

LN基本的病理损害为肾小球系膜细胞不同程度的增生，T淋巴细胞、单核细胞的浸润与核碎裂，肾小管间质纤维化以及肾小球血管病变[12，13]。在LN患者肾组织活检中发现肾小球系膜细胞增生，大量的免疫复合物沉积于肾小球系膜区，在电镜下肾小球系膜区内存在数量不等的电子致密物沉积，可见肾小球系膜细胞在LN形成中具有重要作用[14]。

研究表明Th1细胞过度活化导致的T细胞亢进是LN发病中重要的环节。在Th1型淋巴细胞为主的慢性炎症性疾病中，IFN-γ是最有效的促炎因子[15]，因此本实验以肾小球系膜细胞为研究对象，以IFN-γ为诱导剂，探讨IFN-γ是否能诱导SV40MES13表达CXCL10。应用不同浓度的IFN-γ刺激细胞不同时间后发现，IFN -γ能诱导SV40MES13表达CXCL10 mRNA，并呈时间、剂量依赖性。当IFN-γ的浓度为1000U/ml，CXCL10 mRNA相对表达量是空白组的72.35倍（P＜0.01），之后随着IFN-γ浓度的增加，CXCL10 mRNA表达进入平台期。因此我们推测，在LN中肾小球系膜细胞受到IFN-γ等前炎症因子刺激后表达大量的CXCL10，CXCL10通过与免疫细胞表面的CXCR3受体结合后，激活与趋化CD4+T细胞、巨噬细胞、NK细胞等免疫细胞迁移至肾组织中，从而参与炎症反应，促进了肾损害以及肾小球的硬化，最终诱发狼疮肾炎。

JAK/STAT信号通路是一条由多种细胞因子共同作用的信号转导途径，IFN-γ是此信号通路重要的激活剂[16]。为了验证IFN-γ诱导SV40MES13表达CXCL10与JAK/STAT信号通路之间的关系，本实验选用JAK/STAT信号通路特异性抑制剂AG490预处理SV40MES13，之后加入IFN-γ共培养。结果显示，AG490能明显抑制CXCL10 mRNA的表达，与刺激组相比AG490对CXCL10 mRNA的抑制率为78.4%（P＜0.01）。可见，IFN-γ可能通过激活JAK/STAT信号通路诱导细胞表达CXCL10，通过阻断JAK/STAT信号通路对减少CXCL10的表达、减少淋巴细胞的浸润、减轻或阻止炎症反应的发生对LN的治疗具有重要意义。

TPL具有抗炎、免疫抑制等药理作用，在临床上应用于各种肾脏疾病的辅助治疗中。我们通过CCK-8法检测不同浓度TPL对SV40MES13的细胞毒性，选用细胞毒性小TPL用于后续试验；为了探讨TPL是否能抑制IFN-γ诱导的CXCL10 mRNA的表达，本实验采用不同浓度TPL对细胞表达CXCL10进行干预。结果显示，TPL能明显抑制IFN-γ诱导的CXCL10 mRNA表达，与刺激组相比2ng/ml TPL对CXCL10 mRNA抑制率为45.4%（P＜0.01），4ng/ml的TPL对CXCL10 mRNA的抑制率为65.4%（P＜0.01）；8ng/ml的TPL对CXCL10 mRNA的抑制率为89.76%（P＜0.01）。由此可见，TPL 对IFN-γ诱导的CXCL10 mRNA表达具有明显抑制作用。

综上所述，IFN -γ能够诱导体外培养的SV40MES13表达CXCL10 mRNA，其诱导机制可能与JAK/STAT信号通路的活化有关。TPL对 IFN-γ诱导的CXCL10的表达具有抑制作用，有关TPL调控CXCL10表达的机制与JAK/STAT信号通路是否存在一定联系值得我们进一步去研究。

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中图分类号：R-332，R593.24+2

文献标识码：A

文章编号：1674-1129(2016)03-0267-04

DOI：10.3969/j.issn.1674-1129.2016.03.003

基金项目：福建省自然科学基金(2013J01323)

作者简介：施栋梁，男，1990年8月生，硕士研究生，临床检验诊断学，主要从事免疫实验与临床相关研究

通信作者：林青，女，1969年4月生，硕士，主任技师，临床检验诊断学，主要从事免疫疾病的临床检验与研究工作，E-mail：fjlinqing@126.com

(收稿日期2016-03-24；修回日期2016-04-20)

Inhibitory effects of triptolide on the expression of CXCL10 in mice glomerular mesangial cells

SHI Dongliang，ZHU Xian-jin，LIN Qing，et al. Fujian University of Traditional Chinese Medicine，Fuzhou 350108，China.

Abstract：Objective To investigate the effects of triptolide（TPL）on the expression of CXCL10 mRNA induced by interferon gamma(IFN-γ) in mouse glomerular mesangial cells(SV40MES13) and its mechanism. Methods SV40MES13 were randomly divided into blank group，stimulation group，intervention group. Different concentrations of IFN-γ(0U/ml～2000U/ml) were used to stimulate the cells with different time(0h～48h)，and then observe the changes of the expression of CXCL10 mRNA；CCK8 assay was used to detect the effects of different concentrations of TPL(2ng/ml～20ng/ml) on the survival rate of SV40MES13. The appropriate concentration of TPL causing cell survival rate >85% was applied to subsequent experiment，and then observe the effect of TPL on the expression of CXCL10 mRNA；JAK/STAT signaling pathway specific inhibitor AG490 was used to intervene in cells to investigate whether IFN-γ induced the expression of CXCL10 through the JAK/STAT signaling pathway. Real-Time PCR was used to detect the expression level of mRNA CXCL10. Results The present study showed that IFN-γ induced the expression of CXCL10 mRNA in SV40MES13 through a dose- and time-dependent manner；The JAK/STAT signaling pathway specific inhibitor AG490 inhibit the expression of CXCL10 mRNA induced by IFN-γin SV40MES13；TPL could inhibit the expression of CXCL10 mRNA induced by IFN-γ in SV40MES13 as well. Conclusion IFN -γ could induce expression of CXCL10 by activating JAK/STAT signaling pathway in SV40MES13；TPL could inhibit expression of CXCL10 by blocking JAK/STAT signaling pathway in SV40MES13.

Key words:Triptolide；IFN-γ；Glomerular Mesangial Cell；CXCL10；JAK/STAT