两种用于人乳头瘤病毒检测方法的比较分析

陈文学，邹学森，黄秀珍，陈芸

(1、江西省肿瘤医院检验科，江西　南昌330029；2、江西省精神病院检验科，江西　南昌330029)



·实验研究·

两种用于人乳头瘤病毒检测方法的比较分析

陈文学1，邹学森1，黄秀珍1，陈芸2

(1、江西省肿瘤医院检验科，江西南昌330029；2、江西省精神病院检验科，江西南昌330029)

摘要：目的通过对核酸快速导流杂交基因芯片技术与荧光PCR技术检测人乳头瘤病毒的结果进行比较，为临床人乳头瘤病毒的诊断提供恰当的检测方法。方法采用人乳头瘤病毒分型基因芯片检测系统和荧光PCR技术对78例子宫颈癌患者的宫颈脱落细胞进行人乳头瘤病毒检测。结果基因芯片分型检测总阳性率为91.03%(71/78)，且均为高危型。单一感染52例，其中HPV16型阳性率为61.54%，HPV18阳性率为11.54%，其他类型感染阳性率26.92%。荧光PCR法检测总阳性率为93.59%(73/78)，其中HPV16阳性检出率45.21%，HPV18阳性检出率9.59%。两种检测方法的符合率为97.4%。结论HPV导流杂交基因芯片技术和荧光PCR技术两者具有良好的符合性，两者都适用于临床检测，荧光PCR技术更适用与宫颈癌的大范围筛查。

关键词：人乳头瘤病毒；基因芯片法；荧光PCR技术

人乳头瘤病毒（HPV）感染是导致宫颈癌发生的主要原因，且不同的HPV亚型的致病能力也不同，高危型HPV的持续感染是促进宫颈癌发生的主要因素[1，2]大部分HPV感染无临床症状，不能通过常规的体检发现，只有通过专门针对HPV的检测才能发现。HPV的检测方法主要有细胞学方法和分子生物学检测。HPV分子生物学检测方法包括杂交捕获法、荧光PCR方法、原位杂交、斑点印记法等[3-6]。本研究通过对比其中两种主要的方法导流杂交技术及荧光PCR技术检测人乳头瘤病毒，评价其在宫颈癌患者感染筛查中的应用。

1　资料与方法

1.1研究对象2015年1月至4月江西省肿瘤医院初诊宫颈癌患者72例，年龄32~68岁，所有患者均经病理证实为宫颈癌，并且无急性生殖道炎症，标本采集前3d未使用阴道内药物或阴道冲洗，标本采集在非月经期进行。

1.2研究方法

1.2.1导流杂交基因芯片技术试剂使用潮州凯普公司的HPV基因微阵列分型检测试剂盒，仪器使用HybriMaxTM医用核酸分子快速杂交仪。潮州凯普HPV基因微阵列分型检测试剂盒可检测出15中高危型HPV病毒（HPV16、18、31、33、35、39、45、51、52、53、56、58、59、66、68），6种低危型HPV病毒[HPV6、11、42、43、44，CP8304（81）]。

1.2.2荧光PCR方法采用潮州凯普生物有限公司生产HR-HPV核酸检测试剂盒检测高危型HPV，同时对HPV16和HPV18进行分型检测，可在同一反应管中通过仪器的4种荧光检测通道分别检测：⑴不分型12种HR-HPV(31，33，35，39，45，51，52，56，58，59，66，68)；⑵HPV16；⑶HPV18；⑷细胞内β-globin基因。

1.2.3统计方法采用SPSS 18.0统计软件进行数据分析。

2　结果

基因芯片法可以检测21种HPV亚型，包括中国人常见的感染15种高危型、6种低危型HPV感染，荧光定量PCR检测方法可以检测HPV16、HPV18和其他12种高危混合型HPV感染。本研究针对两种方法对高危型HPV检测进行比较。

2.1HPV基因芯片法检测结果78例宫颈癌标本中HPV感染71例，感染率为91.03%，且均为高危型感染，其中单一感染52例，HPV16型感染32例，阳性率为61.54%，HPV18型感染6例，阳性率为11.54%，其他类型感染14例，占26.92%。多重感染16例，含有HPV16、HPV18、或HPV16/ HPV18双重感染的标本15例。单一HPV亚型感染分布见表1。

表1　52例宫颈癌标本单一感染亚型分布表（基因芯片法）

2.2荧光PCR法检测结果78例宫颈癌标本中检测出73例高危型阳性，阳性率为93.59%，其中HPV16单通道阳性33例，阳性检出率45.21%，其中HPV18单通道阳性7例，阳性检出率9.59%，其他类型HPV感染单通道阳性的标本15例，两通道阳性16例，其中HPV16/HPV18双通道阳性2例，HPV16/Others双通道阳性13例，HPV18/Others双通道阳性1例，三通道感染HPV16/HPV18/Others阳性2例。各亚型分布见表2。

2.3两种检测方法的比较在78例标本中，基因芯片法高危阳性率为91.03%（71/78），荧光PCR法高危阳性率为93.59%(73/78)，两种方法的高危型阳性率没有统计学意义（P>0.05），两种方法有76例结果一致，总符合率为97.4%，其中1例基因芯片法检测的高危阳性，荧光PCR法未检出，1例基因芯片法检测阴性，荧光PCR法检测阳性。

表2　73例宫颈癌标本HPV感染亚型分布表（荧光PCR法）

3　讨论

HPV是导致宫颈癌发生的主要因素，高危型HPV在宫颈癌患者中的感染率为88.4%~99.7%[7，8]。HPV不能进行体外培养，血清学检测准确性较差，因此目前主要的检测手段是形态学方法和分子生物学方法。形态学方法主要以挖空细胞为主要诊断依据，因此特异性和敏感性较差，分子生物学技术中PCR方法是目前检测敏感性和特异性均较高的方法。本研究重点基因芯片法和荧光PCR技术均是以PCR方法为基础的。

基因芯片法是通过将分子探针固定于支持物上，与PCR产物或标本分子的核酸进行杂交，通过检测杂交探针的信号从而获得标本的信息。基因芯片法可检测同一标本中的多种HPV感染亚型，同时可判断多重感染[9-12]。

荧光PCR技术是设计出特异性引物及荧光标记探针，利用PCR技术扩增特定的靶区域，探针与引物同时结合于模板链上，荧光信号随PCR产物增多而增强，通过荧光信号的强弱判断PCR产物多少。

本研究通过对比基因芯片法和荧光PCR法检测宫颈癌患者HPV的阳性率发现两种方法检测标本符合率很高，达到97.4%，HPV高危型感染率相近，无统计学差异。这与蒋卫[13]报道的结果基因芯片法与荧光定量法检测的符合率97.5%~100%一致。也有研究报道[14]基因芯片法的HPV检出率（90%）明显高于荧光定量PCR方法（36.57%）。胡丽杰报道[15]基因芯片分型检测法阳性率为78.79%，明显高于荧光定量PCR法(40，91%)和免疫组化法（38.89%）。对于文献报道的HPV检出率有较大差异，尤其是荧光定量PCR方法HPV的检出率40.91%~93.59%，分析可能的原因⑴HPV检测商品试剂盒的质量参差不齐，导致检测结果出现较大差异。⑵不同的检测方法有不同的灵敏度，PCR方法的灵敏度高于免疫组化法。⑶所采用的标本类型不同脱落细胞和肿瘤组织的检出率也不同。

本研究还发现1例基因芯片法的检测结果阴性，荧光PCR法检测阳性，1例荧光PCR法检测阴性而基因芯片法检测阳性。分析可能的原因：基因芯片法检测的HPV的L区，荧光PCR法检测HPV的E区，基因芯片法检测阴性的这个病例可能是HPV的L区丢失，而E区能够检测出。文献报道宫颈癌HPV感染的患者中存在一部分L区丢失的现象，导致L区丢失的原因目前还不明确。因此基因芯片法和荧光PCR法各有优点，基因芯片法能够对HPV进行具体分型，有利于后期的随访，但是存在检测的目的基因L区丢失导致的假阴性，荧光PCR方法检测通量大，方便大规模的体检，但是对HPV不能具体分型不利于随访观察。两种方法结合用于临床检测可以有效地弥补两种检测方法的不足。

参考文献

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中图分类号：R446.62，R737.33，R730.2

文献标识码：A

文章编号：1674-1129(2016)03-0291-03

DOI：10.3969/j.issn.1674-1129.2016.03.011

基金项目：江西省卫生计生委课题，编号：20155471

作者简介：陈文学，女，1975年2月出生，博士学位，副主任技师、专业：肿瘤分子生物学、研究方向：肿瘤诊断。

(收稿日期2015-07-30；修回日期2016-04-14)

Comparison and analysis of two test methods of human papilloma virus

CHEN Wen1，ZOU Xuesen1，HUANG Xiuzhen1，CHEN Yun2. 1.Clinical Laboratory，Jiangxi Provincial Cancer Hospita，Nanchang 330029，China；2.Clinical Laboratory，Jiangxi Mental Health Centre，Nanchang 330029，China.

Abstract：Objective To find a better method for HPV test through the comparison of the human papilloma virus (HPV) test results using HPV genotyping chip system and fluoresence PCR method，respectively. Methods HPV were tested in 78 cervical exfoliative cell specimens of cervical cancers using HPV genotyping chip system and fluorensence PCR，respectively. The positive rate of HPV detected by HPV genotyping chip system is 91.03%(71/78)，and all of HPV detected were types of high risk. Among 52 case of single HPV infection，HPV16 positive rate was 61.54%；HPV18 positive rate is 11.54%；other type HPV positive rate is 26.92%. The HPV positive rate detected by fluorescence PCR is 93.59%(73/78)，among which HPV16 positive rate is 45.21% and HPV18 positive rate was 9.59%. The coincident rate of two test methods was 97.4%. Conclusion Two test methods exhibited good conformance，and were capable of clinically HPV testing. Fluorescene PCR methods were appropriate for large-scale cervical cancer screening.

Key words:Human papilloma virus；Genotyping chip technique；Fluoresence PCR technique