胆红素对HBV DNA定量检测结果的影响

崔蕾蕾，邵可可，左月媛

(盐城市第一人民医院检验科，江苏　盐城224001)



·综述·

胆红素对HBV DNA定量检测结果的影响

崔蕾蕾，邵可可，左月媛

(盐城市第一人民医院检验科，江苏盐城224001)

摘要：目的探讨高胆红素血清对实时荧光定量聚合酶链反应（PCR）检测乙型肝炎病毒核酸(HBV DNA)的影响，并选择有效减低胆红素对HBV DNA测定干扰的方法。方法将不同浓度的HBV DNA标准品（S1-S4：3.0×107、3.0×106、3.0×105、3. 0×104IU/ml）按相同比例分别添加到胆红素正常血清和高胆红素血清中，按不同浓度胆红素进行分组来考察不同浓度胆红素血症对HBV DNA测定结果的影响程度大小，然后再分别测定HBV DNA的结果，每个标本重复检测三次，同时观察扩增曲线是否存在差异。对影响测定的血清标本作10、100、1000倍稀释后，进行检测，并收集5例临床高胆红素的乙肝血清标本进行验证。结果血清胆红素浓度介于401~500μmol/L、501~600μmol/L、>600μmol/L三个组，HBV DNA定量检测结果高于胆红素正常血清组，差异有统计学意义（P＜0.05），血清胆红素浓度浓度介于20.6~100μmol/L、101~200μmol/L、201~300μmol/L和301~400μmol/L四个组，与胆红素正常血清组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）；血清胆红素浓度高于400μmol/L血清扩增时，扩增曲线先缓慢升高，其基线高于标准品，其阈值线处于拐点之下非S扩增区，之后升高呈现S型曲线；10、100、1000倍稀释后，扩增曲线平行且等间距，结果一致性较好。5例高胆红素血清有4例在定阈值线时，其阈值线处于拐点之下非S扩增区，定值偏高，结果高于稀释后的标本，差异有统计学意义(P＜0.05)；有1例阈值线处于拐点处，其斜率低于标准品，结果低于稀释后的标本，差异有统计学意义(P＜0.05)。结论总胆红素高于400μmol/L对荧光定量PCR检测HBV DNA结果存在影响，通过稀释一般就可以降低胆红素因素干扰。

关键词：实时荧光定量PCR；HBV DNA；胆红素

我国目前有慢性乙型肝炎病毒（HBV）感染者9400万，其中慢性乙型肝炎患者2000万～4000万[1]。血清乙型肝炎病毒核酸（HBV DNA）水平是目前临床上评价HBV复制情况的“金标准”，且对非活动性HBsAg携带状态的判定有重要意义。目前HBV DNA的测定方法大多采用基于Taqman探针技术的实时荧光定量聚合酶链反应(Fluorescence quantitative polymerase chain reaction，FQ-PCR)，该方法具有实时监测，操作简单，定量范围宽，结果重复性好等优点[2-4]。影响PCR测定重复性和准确性的因素，除了PCR本身因素外，标本状态直接影响检验结果的准确性[5-7]，多数学者认为黄疸对HBV DNA定量检测无明显影响[8，9]，而本人在日常工作中发现胆红素浓度过高会导致血清HBV DNA测定结果偏高或偏低，导致结果不准确。本文就不同胆红素水平对HBV DNA定量检测的影响及如何去除胆红素因素干扰作一些探讨。

1　材料与方法

1.1标本来源分别收集乙肝两对半全阴性、HBV DNA阴性、胆红素正常的混合血清(胆红素正常血清)和乙肝两对半全阴性、HBV DNA阴性、高胆红素的混合血清(高胆红素血清)，收集2013年1月至5月门诊及住院乙肝患者的高胆红素血清5例，其中男患者4例，年龄介于31~62岁之间，女患者1例，年龄61岁。

1.2试剂与仪器HBV DNA定量检测试剂购自上海复兴医学科技有限公司，仪器为罗氏公司Lightcycler 480Ⅱ。胆红素检测试剂购自宁波美康，仪器为日本Olympus AU5400全自动生化分析仪。

1.3检测方法⑴将不同浓度的HBV DNA标准品（S1-S4：3.0×107、3.0×106、3.0×105、3.0×104IU/ml）按相同比例分别添加到胆红素正常血清和高胆红素血清中，按不同浓度胆红素进行分组来考察不同浓度胆红素血症对HBV DNA测定结果的影响程度大小，每个标本重复检测三次，同时观察扩增曲线是否存在差异。⑵将扩增曲线异常的高胆红素血清用胆红素正常血清进行稀释，加入HBV DNA标准品，再分别测定HBV DNA的结果，确定多少浓度以下的胆红素对HBV DNA检测不产生影响。⑶将高胆红素血清作10、100、1000倍稀释，进行检测。⑷将临床收集的5例高胆红素的乙肝血清标本进行HBV DNA检测，并作稀释后检测。⑸荧光定量PCR法检测HBV DNA含量，化学氧化反应检测血清总胆红素。

1.4统计学分析实验数据均通过SPSS 18.0软件进行处理，计量数据采用均数±标准差（x±s）表示，组间比较采用t检验P＜0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1不同浓度水平总胆红素血清HBV DNA检测结果血清胆红素浓度介于401~500μmol/L、501~ 600μmol/L、>600μmol/L三个组，HBV DNA定量检测结果高于胆红素正常血清组，差异有统计学意义（P＜0.05），血清胆红素浓度浓度介于20.6~100μmol/ L、101~200μmol/L、201~300μmol/L和301~400μmol /L四个组，与胆红素正常血清组比较，差异无统计学意义（P＞0.05），见表1。血清胆红素浓度高于400μmol/L血清扩增时，扩增曲线先缓慢升高，其基线高于标准品，其阈值线处于拐点之下非S扩增区，定值偏高；之后升高呈现S型曲线，但其斜率低于标准品，见图1。

表1　不同水平总胆红素血清HBV DNA测定结果比较(logC±s)

图1　高胆红素血清扩增曲线

2.2对高胆红素血清进行倍比稀释后的结果将高胆红素患者血清作原倍及10、100、1000倍稀释后测定HBV DNA含量，结果10倍稀释后扩增曲线斜率即接近标准品的扩增曲线，10、100、1000倍稀释后扩增曲线平行且等间距，结果一致性较好，见图2。

图2　高胆红素血清原倍、10、100、1000倍稀释后扩增曲线

2.3临床标本检测结果5例高胆红素血清有4例在定阈值线时，其阈值线处于拐点之下非S扩增区，定值偏高，结果高于稀释后的标本，差异有统计学意义(P＜0.05)；有1例阈值线处于拐点处，其斜率低于标准品，结果低于稀释后的标本，差异有统计学意义(P＜0.05). 5例高胆红素血清用正常血清作10倍和2倍稀释制备总胆红素含量介于3.4~ 100μmol/L、101 ~400μmol/L，对两组血清HBV DNA结果进行比较，差异无统计学意义（P＞0.05），结果见表2。

表2　临床高胆红素血清标本HBV DNA测定结果比较

3　讨论

对实时荧光定量PCR准确性造成影响的因素很多，任何能影响PCR扩增的因素均可影响其扩增的效率及定量的准确度。除了PCR本身因素及反应体系外，样本状态亦可能对检测产生影响，临床上经常会遇到溶血、黄疸和脂血等血清样本，本研究为着重了解胆红素对HBV DNA检测的影响，故在收集试验样本时已对溶血、脂血样本进行排除筛选。

正常人血清总胆红素水平在3.4-20.5μmol/L之间，高胆红素血症在临床较为常见，如急慢性肝性疾病、新生儿黄疸等患者，其血清中总胆红素浓度常明显升高，高胆红素血影响许多临床检测结果的准确性。本研究发现总胆红素高于400μmol/ L，将影响荧光定量PCR法检测HBV DNA含量，对扩增有干扰，影响结果的定值。高胆红素血清扩增时，扩增曲线先缓慢升高，其基线高于标准品，之后升高呈现S型曲线，但其斜率低于标准品，如阈值线处于缓慢升高期，定值不准确，如阈值线抬高至S型曲线拐点处，其斜率低于标准品曲线，这样将导致定值结果偏低。而多数学者认为，黄疸对于HBV DNA检测无影响。这可能与使用不同厂家生产的试剂盒对核酸检测灵敏度不一样、对黄疸标本中的胆红素处理能力不一样有关。

在检测中应尽可能消除胆红素的干扰作用，目前可用化学方法氧化分解胆红素后再进行测定，另外还可以用特异性胆红素吸附剂吸附胆红素来减少对测定结果的影响，但尚未用于临床检测[10-15]。本文对于高胆红素血清采用阴性稀释后再检测HBV DNA含量发现，胆红素对于HBV DNA检测的干扰已大大减低，其扩增曲线斜率已与标准品曲线一致。10、100、1000倍稀释后扩增曲线平行且等间距，结果一致性较好，因此，在重度黄疸血清测定HBV DNA时，如仅采用2倍稀释，可能胆红素浓度仍会过高，影响测定；采用10倍稀释即可将胆红素浓度降至100μmol/L以下，降低了对扩增的干扰。

通过不同水平胆红素对荧光定量PCR测定HBV DNA的探讨，建议临床各实验室进行试剂性能评价时，设立适合本实验室的胆红素评价试验，制定适合本实验室的标本检测程序。

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·论著·

中图分类号：R446.11+2，R512.6+2

文献标识码：A

文章编号：1674-1129(2016)03-0283-03

DOI：10.3969/j.issn.1674-1129.2016.03.008

基金项目：盐城市科技立项课题，编号YK2015002

作者简介：崔蕾蕾，女，1980年9月生，硕士，副主任检验技师，主要研究方向为免疫学和分子生物学。

(收稿日期2016-01-27；修回日期2016-03-23)

Effect of bilirubin on the detection of HBV DNA

CUI Leilei，SHAO Keke，Zuo Yueyuan. Department of Laboratory Medicine，the First People’s Hospital of Yancheng City，Jiangsu Yancheng 224000，China.

Abstract：Objective To investigate the effect of high level of serum bilirubin on detection of hepatitis B virus DNA (HBVDNA) by real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction (RT-qPCR)，and select the effective method to reduce the interference of bilirubin on HBV-DNA detection. Methods The different concentrations of HBV-DNA standard products (S1-S4：3.0×107、3.0×106、3.0×105、3.0×104IU/ml) were added into the serums which contained normal and high concentration of bilirubin，according to the same proportion. The effect of different concentrations of bilirubin on the determination results of HBV-DNA were investigated. Then the detection of HBV-DNA in each serum sample were performed in triplicate，and the difference of the amplification curves was observed. The serum samples diluted by 10，100 and 1000 times were tested，respectively. The serum samples from 5 cases of clinical high bilirubin were collected and used to result validation. Results The level of HBV-DNA in the serums contained bilirubin with the concentrations in 401-500μmol/L，501-600μmol/L，>600μmol/L were significantly higher than that in normal bilirubin group (P<0.05)；compared with normal bilirubin group，there is no siginificant differrence in the level detected of HBV-DNA in serum contained bilirubin with the concentrations in 20.6-100μmol/L，101-200μmol/L，201-300μmol/L and 301-400μmol/L. When the concentration of bilirubin is higher than 400μmol/L，the amplification curve raised slowly at first，and the baseline was higher than the standard. The threshold line was under the inflection point. Subsequently the amplification curve raised as S curve；for the serum samples diluted by 10，100 and 1000 times，the amplification curve was parallel and equal spaced，and the results were consistent. Among 5 clinical cases detected，4 cases presented the threshold line under the inflection point in the non-amplification region of S curve，and the detection results were significantly higher than the samples diluted (P<0. 05)；1 case presented the threshold line through the inflection point in amplification curve，the slope of which was lower than the standard curve，and the detection result was significantly lower than the sample diluted (P<0.05). Conclusion The high level of serum total bilirubin (>400μmol/L) could interfere detection of HBV DNA in fluorescence quantitative PCR，and the interference effect of bilirubin could be reduced by dilution.

Key words：Fluorescence quantitative PCR；HBV-DNA；Bilirubin