阿那其根的指纹图谱研究

霍仕霞，高　莉*，彭晓明，闫　明，刘新民

(1.新疆维吾尔自治区维吾尔医药研究所，新疆维吾尔医方剂学实验室，乌鲁木齐　830049；2.中国医学科学院药用植物研究所，北京　100193)



阿那其根的指纹图谱研究

霍仕霞1，高莉1*，彭晓明1，闫明1，刘新民2

(1.新疆维吾尔自治区维吾尔医药研究所，新疆维吾尔医方剂学实验室，乌鲁木齐830049；2.中国医学科学院药用植物研究所，北京100193)

摘要：目的建立阿那其根药材的高效液相色谱指纹图谱，对共有色谱峰进行指认，为其质量控制提供依据。方法采用HPLC-DAD检测法。VP-ODS色谱柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流动相为乙腈-1 mL·L-1磷酸水溶液；柱温为30 ℃；极性小的成分检测波长为330 nm，流速为1.0 mL·min-1；极性大的成分检测波长为254 nm，流速为0.5 mL·min-1。采用中药色谱指纹图谱相似度评价软件对结果进行评价。结果测定了4批不同来源的阿那其根，其中1批样品的相似度小于0.6，其余药材指纹图谱相似度均大于0.9。结论该方法可靠、简便，适用于阿那其根药材的质量评价。

关键词：阿那其根；高效液相色谱法；指纹图谱；共有峰

阿那其根为菊科植物罗马除虫菊Anacycluspyrethrum(L).DC的干燥根，春秋季采挖，洗净，切断，晒干。维药名：阿克尔开尔哈，别名为阿吉而哈而哈、欧都里开日合、比合台尔混库依。原植物罗马除虫菊，多年生草本，高15～45 cm，多具长柔毛。分布于北非或欧洲南部，我国新疆亦有分布。阿那其根具有清除异常黏液质、开滞止痛的功效，其性味为三级末四级首干热。在维吾尔医中，阿那其根常被用来清除异常黏液质、开滞止痛；用于异常黏液质所致的瘫痪、面瘫、震颤、麻痹和舌重久咳等[1-2]，但是其活性成分及其作用机制还不清楚。阿那其根中含有黄酮、墙草碱、菊糖、挥发油、鞣质及氨基酸[3]。由于其基源主要在国外，新疆所用阿那其根主要从周边的巴基斯坦、印度等国进口，造成了其基源混乱、真伪不清、质量不均，严重阻碍了其相关产品的质量以及其进一步的深入开发。

目前，市场的阿那其根品种层出不穷，名称相同，但基源不同，价格相差很大。为了进一步探究中草药的质量，本研究采用RT-HPLC法分别建立阿那其根极性小部分和极性大部分指纹图谱，并比较了4种市售的阿那其根的指纹图谱，并根据指纹图谱色谱峰数目及大小，评价其质量，从而为规范阿那其根的质量评价提供依据。

1仪器与试药

1.1仪器 LC2010高效液相色谱仪(美国waters公司)；VP-ODS色谱柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)(日本岛津公司)；BS224S分析天平(德国Sartorius)；SK8210HP超声清洗器(上海科导超声仪器有限公司)；FJY2002-UV基因研究型超纯水机(青岛富勒姆科技有限公司)；高速多功能摇摆粉碎机(上海菲力博实业公司)。

1.2试药阿那其根分别购买于巴基斯坦药材市场、新疆维吾尔自治区维吾尔医医院、和田维吾尔医医院和新疆阿勒泰医院，其中在巴基斯坦药材市场购买的阿那其根经巴基斯坦卡拉奇大学分子医学和药物研究中心默哈默得·伊哥巴尔教授鉴定为正品。甲醇(Merck公司，KGaA 1674607308)；乙腈为色谱纯；水为去离子水；其他试剂均为分析纯。

2方法与结果

2.1供试品溶液的制备阿那其根药材粉碎后过60目筛，称取5.00 g，加入适量体积分数为70%的乙醇，超声提取3次(3次加水量依次为药材的8，6和6倍)，每次30 min，过滤，合并滤液，定容至100 mL量瓶中，0.45 μm滤膜过滤，即为供试品溶液。

2.2检测波长的确定将阿那其根指纹图谱分为2部分进行优化，即极性大的部分(A段)和极性小的部分(B段)。通过对比不同波长下色谱峰的数目和大小，A段指纹图谱选择波长为330 nm，B段指纹图谱选择波长为254 nm，见图1。

图1不同波长下阿那其根指纹图谱

A.254 nm；B.330 nm

Fig.1 HPLC fingerprints of RadixAnacyclipyrethriat different wavelength

A.254 nm；B.330 nm

2.3梯度洗脱程序的建立及优化

2.3.1A段(极性大的成分)指纹图谱条件的优化本研究最初采用系统洗脱方式作为初始程序，见图1A，即0～40 min，乙腈的体积分数由1%线性增至100%，流速为1.0 mL·min-1；分析系统梯度洗脱后的色谱图，主要成分的峰集中在10～25 min之间，有15个明显特征峰，出现色谱峰堆积，故调整流动相乙腈-1 mL·L-1磷酸水溶液的初始比例，在此基础上进行色谱条件优化[4-6]。最终优选条件：检测波长：330 nm，进样量：5 μL，柱温：30 ℃，流速：1.00 mL·min-1，流动相比例及梯度洗脱条件见表1，色谱图见图2。

表1阿那其根指纹图谱梯度洗脱程序

Tab.1 The gradient elution program for RadixAnacyclipyrethri

时间/min乙腈/%1mL·L-1磷酸/%01090252179352377552377

图2阿那其根A段(极性大的成分)系统梯度洗脱图谱

Fig.2 HPLC fingerprints of RadixAnacyclipyrethriA(the high polarity composition)

2.3.2B段(极性小的成分)指纹图谱条件的优化对于极性较小的成分采取乙腈的体积分数较大[7]，在已有梯度洗脱的基础上，优化色谱条件，最终优选条件为：乙腈：1 mL·L-1磷酸=85∶15等度洗脱，流速：0.5 mL·min-1，柱温：30 ℃，时间：25 min。色谱图见图3。

图3阿那其根B段(极性小的成分)系统梯度洗脱图谱

Fig.3 HPLC fingerprints of RadixAnacyclipyrethriB(the low polarity composition)

2.4不同来源阿那其根指纹图谱的相似度评价见表2～3。指纹图谱的相似度评价指标是将供试品的色谱图和该品种的对照指纹图谱(共有模式图谱)之间的相似度进行比较和计算，将相似度值高的样品定为质量较高的药材。在2002年国家药典委员会发布的《中药注射剂色谱指纹图谱实验研究技术指南》(试行)中要求对照用指纹图谱(共有模式)及供试品指纹图谱之间的相似度必须在0.900以上[8-10]。本研究比较了各来源的阿那其根指纹图谱色谱峰数目和大小，选择图谱中归一化峰面积大于2%的色谱峰作为指纹峰，对于极性较大的成分最终选择了23个指纹峰(占总峰面积的95%以上)，对于极性小的成分，选择了8个指纹峰(占总峰面积的95%以上)，利用中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2004 A版)[11-12]分别对极性大和极性小的成分的指纹图谱进行匹配，见图4～5。

图4不同来源的阿那其根极性大的成分指纹图谱

(S1.巴基斯坦药材市场样品；S2.新疆维吾尔自治区维吾尔医医院样品；S3.和田维吾尔医医院样品；S4.新疆阿勒泰医院样品)

Fig.4 HPLC fingerprints of different RadixAnacyclipyrethriA(the high polarity composition)

(S1.Samples of medicine market of Pakistan；S2.Samples of Xinjiang Uygur medicine hospital；S3.Samples of Uygur medicine hospital of Hetian；S4.Samples of Altay hospital)

表2不同来源阿那其根极性大的成分指纹图谱相似度评价结果

Tab.2 The similarity evaluation results of different RadixAnacyclipyrethriA(the high polarity composition)

相似度S1S2S3S4S11S20.9981S30.9950.9951S40.2210.2210.2531

注：S1.巴基斯坦药材市场样品；S2.新疆维吾尔自治区维吾尔医医院样品；S3.和田维吾尔医医院样品；S4.新疆阿勒泰医院样品。

图5不同来源的阿那其根极性小的成分指纹图谱

S1.巴基斯坦药材市场样品；S2.新疆维吾尔自治区维吾尔医医院样品；S3.和田维吾尔医医院样品；S4.新疆阿勒泰医院样品

Fig.5 HPLC fingerprints of different RadixAnacyclipyrethriB(the low polarity composition)

S1.Samples of medicine market of Pakistan；S2.Samples of Xinjiang Uygur medicine hospital；S3.Samples of Uygur medicine hospital of Hetian；S4.Samples of Altay hospital

表3不同来源阿那其根极性小的成分指纹图谱相似度评价结果

Tab.3 The similarity evaluation results of different RadixAnacyclipyrethriB(the low polarity composition)

相似度S1S2S3S4S11S20.9961S30.9940.9941S40.530.530.4371

注：S1.巴基斯坦药材市场样品；S2.新疆维吾尔自治区维吾尔医医院样品；S3.和田维吾尔医医院样品；S4.新疆阿勒泰医院样品。

由相似度评价结果可以得出，从巴基斯坦药材市场、新疆维吾尔自治区维吾尔医医院与和田维吾尔医医院购买的阿那其根药材指纹图谱相似度较高，均大于0.9；而新疆阿勒泰医院的阿那其根药材指纹图谱与其他三者相似度较低，小于0.6。

3讨论

简单的测定1个或几个有效成分含量为主的传统的质量分析方法不能真正地反映中药材的质量，中药指纹图谱是控制天然药物质量的有效方式之一，建立全面、系统而又特征地反映中草药的化学成分的指纹图谱，能为中草药的质量评价和控制提供一个有效的参考方法[8]。

梯度洗脱分离条件的优化是指纹图谱建立的关键[13-14]。阿那其根中含有黄酮、墙草碱、菊糖、挥发油、鞣质及氨基酸，具有一定的极性和酸性，易解离出质子，在流动相中添加适当比例的磷酸可抑制解离以获得稳定的色谱峰。本研究比较了甲醇(A)-2 mL·L-1甲酸水溶液(B)、乙腈(A)-1 mL·L-1磷酸水溶液(B)等流动相的分离效果，结果表明，同一条件下采用乙腈体系作为流动相，较甲醇的分离效果好，可以缩短保留时间，最终选择乙腈-1 mL·L-1磷酸水溶液作为基本的流动相单元。

研究中阿那其根系统洗脱指纹图谱主要集中在10～30 min和45～60 min两段，且色谱峰较集中，很难在短时间内分离达到满意效果，因此考虑分成两段(极性大的部分和极性小的部分)进行分离。作者在阿那其根的提取溶剂、流动相的选择、梯度洗脱等方面进行了大量的优化，所建立的方法在精密度、重复性和稳定性方面符合指纹图谱研究的技术要求，也为阿那其根的质量控制提供部分的科学依据。通过指纹图谱相似度评价后，我们比较了从巴基斯坦药材市场、新疆维吾尔自治区维吾尔医医院、和田维吾尔医医院和新疆阿勒泰医院购买的阿那其根，通过指纹图谱及相似度评价，结果显示，巴基斯坦药材市场、新疆维吾尔自治区维吾尔医医院与和田维吾尔医医院购买的阿那其根药材指纹图谱相似度较高，均大于0.9，其中从巴基斯坦市场购买的药材经专家鉴定确定为正品，表明新疆维吾尔自治区维吾尔医院与和田维吾尔医医院的阿那其根与巴基斯坦市场的阿那其根质量相当；而新疆阿勒泰医院的阿那其根药材指纹图谱与其他三者比较相似度较低，小于0.6，色谱峰数目明显较少，质量差异较大，品质较次。当然，由于阿那其根药材资源的多样性、采集时间的差异性、存放时间引起的化学成分变化和温度等复杂因素对指纹图谱的影响，还不能做出明确结论，只能给出一个初步的质量评价。

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基金项目：新疆维吾尔自治区国际科技支疆项目(编号：201491174)

作者简介：霍仕霞，女，硕士研究生，副研究员

*通信作者：高莉，女，博士，副研究员

doi:10.3969/j.issn.1004-2407.2016.04.004

中图分类号：R284.1

文献标志码：A

文章编号：1004-2407(2016)04-0341-04

(收稿日期：2015-09-22)

Study on the HPLC fingerprint of the Radix Anacycli pyrethri

HUOShixia1，GAOLi1*，PENGXiaoming1，YANMing1，LIUXinmin2

(1.Xinjiang Institute of Traditional Uighur Medicine；Xinjiang Laboratory of Uighur Medical Prescription，Urmuqi 830049，China；2.Institute of Medicinal Plant Development，Chinese Academy of Medical Sciences，Beijing，100193，China)

Abstract:Objective To optimize the separation conditions of fingerprint for Radix Anacycli pyrethri by high performance liquid chromatography.Methods HPLC-DAD analysis was performed, and VP-ODS column(250 mm×4.6 mm，5 μm) was used with acetonitrile-1 mL·L-1phosphoric acid solution as the mobile phase.The low polarity components were detected at UV 330 nm in a flow rate of 1.0 mL·min-1，while the high polarity components were detected at UV 254 nm in a flow rate of 0.5 mL·min-1.The column temperature was maintained at 30 ℃.The result was evaluated by similarity evaluation system for chromatographic fingerprint of traditional Chinese medicines.Results Four batches of Radix Anacycli pyrethri were tested，the similarity of Radix Anacycli pyrethri from Altay Hospital was less than 0.6，but the others were over 0.9.Conclusion The method is reliable，simple and suitable for the quality evaluation of Radix Anacycli pyrethri.

Key words：Radix Anacycli pyrethri；HPLC；fingerprint；common chromatographic peaks