乳腺癌细胞中缺氧诱导因子-1α和miR-210的表达及其调控

蓝永洪　牛海艳　王　晗　杨　智　江朝娜　符碧薇　齐亚灵

(海南医学院，海南　海口　571199)

乳腺癌细胞中缺氧诱导因子-1α和miR-210的表达及其调控

蓝永洪牛海艳王晗杨智江朝娜符碧薇齐亚灵

(海南医学院，海南海口571199)

〔摘要〕目的探讨乳腺癌MCF-7细胞中缺氧诱导因子(HIF)-1α与microRNA-210(miR-210)的表达情况及二者之间的调控关系。方法应用Western印迹和实时荧光定量聚合酶链反应(PCR)技术分别检测MCF-7细胞中HIF-1α和miR-210的表达情况。分别构建针对HIF-1α和miR-210的shRNA质粒表达载体，利用LipofectamineTM2000转染至MCF-7细胞中，观察HIF-1α和miR-210的表达情况。结果MCF-7细胞中存在HIF-1α和miR-210表达，转染HIF-1α的shRNA后HIF-1α和 miR-210的表达明显下降；转染miR-210的shRNA后HIF-1α表达没有变化，但miR-210的表达明显下降。结论乳腺癌MCF-7细胞中存在HIF-1α和miR-210表达，HIF-1α可正向调控miR-210的表达。

〔关键词〕缺氧诱导因子-1α；microRNA-210；乳腺癌；调控关系

肿瘤生长迅速，其增生速度超过周围血管的生长速度，导致局部缺氧，缺氧是多数实体肿瘤的特征〔1〕。缺氧与肿瘤的侵袭、血管生成和凋亡有关，并且增加了转移的风险，影响预后〔2〕。作为低氧诱导产物，缺氧诱导因子(HIF)-1α与miR-210在乳腺癌组织中均明显上调〔3，4〕，且与乳腺癌的发生发展及预后密切相关〔5，6〕，但是HIF-1α与miR-210在乳腺癌生物学行为中如何相互调控仍需深入探讨。本研究观察miR-210与HIF-1α的表达情况，分析二者在乳腺癌细胞中的调控关系。

1材料与方法

1.1主要试剂和仪器人乳腺癌MCF-7细胞购自中国科学院细胞库，DMEM培养液购自北京索莱宝科技有限公司，胎牛血清购自浙江天杭生物科技有限公司，胰酶和OPTI-MEM购自美国Gibco公司，LipofectamineTM2000试剂盒购自美国Invitrogen公司，HIF-1α和miR-210的shRNA质粒表达载体购自武汉淅玛生物技术有限公司，引物均由北京赛百盛基因技术有限公司合成，十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)凝胶快速配制试剂盒、二氨基联苯胺(DAB)辣根过氧化物酶显色试剂盒、小鼠抗人HIF-1α抗体、小鼠抗人Actin抗体、辣根过氧化物(HRP)标记的山羊抗小鼠抗体、聚偏二氟乙烯(PVDF)膜购自碧云天生物技术公司，总RNA提取试剂盒(DP430)、cDNA 第一链合成试剂盒(KR103)、SuperReal 荧光定量预混试剂(FP205)购自北京天根生化科技有限公司，CO2培养箱(4750E)购自美国NuAire公司，超净工作台购自苏州安泰空气技术有限公司，微型垂直电泳槽(VE180)、半干转移电泳槽(VE 386)购自上海天能科技有限公司，核酸蛋白测定仪购自德国Eppendorf公司，荧光定量 PCR 仪(Mx3005P)购自美国Agilent公司。

1.2细胞培养及转染细胞常规复苏后，用10%胎牛血清的DMEM培养液，置于37℃、5%CO2培养箱中进行培养，胰酶消化传代。转染前1 d，以1×105/孔的密度接种6孔板，待细胞密度约为90%后，按LipofectamineTM2000转染试剂盒说明书进行瞬时转染，实验分为对照组和转染组。转染A液：将10 μl Lipo2000加至240 μl的Opti-MEM中轻轻混匀，室温静置5 min；转染B液：将4 μl质粒体或阴性对照加至246 μl Opti-MEM中轻轻混匀，将A 液与B液混匀，静置20 min；对6孔板的细胞进行换液，每孔加2 ml的Opti-MEM，然后将500 μl混合液加入6孔板中，轻轻混匀，6 h后进行换液，用10%胎牛血清的DMEM培养液进行培养，48 h后观察HIF-1α和miR-210的表达情况。

1.3Western印迹检测HIF-1α蛋白的表达取MCF-7细胞，去除培养液，用磷酸盐缓冲液(PBS)漂洗3次，加入终浓度为1 mmol/L苯甲基磺酰氟(PMSF)的SDS裂解液，吹打数下，使裂解液和MCF-7细胞充分接触，然后用细胞刮子刮下细胞，吸至微量离心管，4℃14 000 r/min离心5 min，吸取上清液，采用二辛可宁酸(BCA)蛋白浓度测定试剂盒测定蛋白浓度。取50 μg蛋白质行8%SDS-PAGE电泳，然后转移至PVDF膜上，用含4% BSA的磷酸盐吐温缓冲液(PBST)1封闭1 h，PBST洗膜，加入鼠抗人HIF-1α抗体(1∶500)和内参Actin(1∶1 000)，4℃过夜，PBST洗膜，加入HRP标记的羊抗鼠二抗(1∶1 000)，并于室温下孵育1 h，PBST洗膜，采用DAB显色，观察结果，并进行灰度值分析，计算HIF-1α/Actin的灰度值作为蛋白相对表达量。

1.4实时荧光定量PCR检测miR-210的表达引物由公司合成，其中反转录特异性引物序列为：5′-GTCGTATCCAGTGCAGGGT CCGAGGTATTCGCACTGGATACGACTCAGCC-3′；miR-210的上游引物序列为：5′-CGCCTGTGCGTGTGACAGCG-3′，下游：GTGCAGGGTCCGAGGT，产物大小71 bp；内参U6上游引物序列为：5′-GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT-3′，下游：5′-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT-3′，产物大小89 bp。取MCF-7细胞，提取细胞的总RNA，检测总RNA浓度，然后将其反转录为cDNA，其反应体系为20 μl，分别加入RNA模板1 μg，10×RT Mix 2 μl，Super Pure dNTP(2.5 nmol/L ench)2 μl，特异性引物2 μl，Quant Reverse Transcriptase 1 μl，然后加RNase-Free ddH2O至20 μl，彻底混匀后简短离心，37℃孵育60 min，置于-20℃保存。以cDNA为模板进行实时荧光定量PCR，其反应体系为20 μl，分别加入cDNA模板1 μl，2× SuperReal PreMix Plus 10 μl ，上游引物0.6 μl，下游引物0.6 μl，50×ROX Reference 0.4 μl，然后加RNase-Free ddH2O至20 μl，彻底混匀后简短离心，反应条件：预变性95℃ 15 min，95℃ 10 s，62℃ 31 s，45个循环，以2-△△Ct值表示miR-210的相对表达量。

1.5统计学方法采用SPSS17.0统计软件进行t检验。

2结果

2.1HIF-1α和miR-210的表达MCF-7细胞中存在HIF-1α蛋白的表达，将实时荧光定量PCR的扩增产物进行电泳，MCF-7细胞中存在miR-210的表达，见图1。

2.2转染HIF-1α的shRNA后 HIF-1α和miR-210的表达HIF-1α的shRNA转染后，转染组MCF-7细胞中HIF-1α(0.082±0.008)和miR-210的表达水平明(0.306±0.04)显低于对照组(0.353±0.004、1.056±0.116)(P<0.05)，见图2。

图2　转染HIF-1α的shRNA后 HIF-1α和miR-210的表达情况

2.3转染miR-210的shRNA后 HIF-1α和miR-210的表达miR-210的shRNA转染后，与对照组(0.332±0.011)相比，转染组MCF-7细胞中HIF-1α表达(0.306±0.019)没有明显变化(P>0.05)，而miR-210的表达水平明显下降(0.235±0.021 vs 1.016±0.034)(P<0.05)，见图3。

图3　转染miR-210的shRNA后 HIF-1α和miR-210的表达情况

3讨论

乳腺癌发病率呈逐渐上升趋势，已跃居女性恶性肿瘤的首位或第二位〔7〕。肿瘤的侵袭和转移是影响预后、导致患者死亡的主要原因〔8～10〕。HIF-1是缺氧条件下存在于哺乳动物和人体的一种转录因子〔11〕。研究证实HIF-1主要以异源二聚体形式存在，由120 kD的α亚基(HIF-1α)和91/93/94 kD(3种分子量)的β亚基(HIF-1β)组成。HIF-1α和HIF-1β同属于Bhlh-PAS转录因子家族，HIF-1活性的调节主要通过α亚基完成，具有一个或多个有效的转录活化区域，直接或间接与转录起始复合物反应影响基因转录〔12〕。微小RNA(miRNA)作为小RNA的一种，可与其靶mRNA的非翻译区特异性结合引起靶mRNA的翻译抑制或降解，在细胞的生长分化等过程中发挥癌基因或抑癌基因的作用〔13〕。miR-210是低氧应答中的主要miRNA，因为迄今为止，miR-210在低氧状态下，在所有的细胞和组织中表达上调〔14〕。本研究结果说明miR-210随着HIF-1α的变化而变化，而HIF-1α不受miR-210水平的影响，表明HIF-1α可以调节miR-210的表达，其原因可能为，HIF-1α可在miR-210启动子处直接与转录起始位点上游大约40 bp的缺氧反应原件(HER)结合，发挥转录调控作用，从而正向调控miR-210的表达，然后可能通过miR-210作用于靶基因在乳腺癌细胞的增殖、侵袭和凋亡等方面发挥重要的作用，从而影响乳腺癌的发生发展及预后，因此对于HIF-1α和miR-210的进一步研究有可能为乳腺癌的靶向治疗方面提供新的思路和策略。

4参考文献

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13Khoshnaw SM，Green AR，Powe DG，etal.MicroRNA involvement in the pathogenesis and management of breast cancer〔J〕.J Clin Pathol，2009；62(5)：422-8.

14Kulshreshtha R，Ferracin M，Wojcik SE，etal.A microRNA signature of hypoxia〔J〕.Mol Cell Biol，2007；27(5)：1859-67.

〔2014-12-11修回〕

(编辑苑云杰)

基金项目：海南省自然科学基金(No.814301)；海南医学院科研培育基金(No.HY2013-12)

通讯作者：齐亚灵(1967-)，女，教授，医学博士，博士生导师，主要从事肿瘤基因诊断及生物治疗研究。

〔中图分类号〕R730

〔文献标识码〕A

〔文章编号〕1005-9202(2016)11-2623-03；

doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.11.025

第一作者：蓝永洪(1978-)，男，硕士，副研究员，主要从事分子病理学研究。