广西壮族儿童肥胖与黑素皮质素受体基因rs17782313位点多态性的关系

唐宁　陈艺丹　曾婷　覃正学　严提珍　罗世强　李伍高　李静文　王秋华　李哲涛



广西壮族儿童肥胖与黑素皮质素受体基因rs17782313位点多态性的关系

唐宁1陈艺丹2曾婷3覃正学4严提珍1罗世强1李伍高1李静文1王秋华1李哲涛1

［摘要］目的探讨黑素皮质素基因MC4R单核苷酸多态性位点rs17782313与壮族儿童单纯性肥胖的相关性。方法利用SNaPshot技术分析收集到的285儿童（151例广西柳州壮族单纯性肥胖儿童和134例健康对照儿童）MC4R基因rs17782313位点的基因型，记录身高体重，并测定空腹血糖（serum fasting glucose，FBG）、胆固醇（cholesterol，TC）、甘油三酯（triglyceride，TG）、高密度脂蛋白（high⁃density lipoprotei，HDL⁃C）及低密度脂蛋白（low⁃density lipoprotein，LDL⁃C）。结果正常对照组和肥胖组MC4R基因CC型、CT型及TT型基因型频率分别为1.49%、26.11%、72.39%和3.31%、32.45%、64.24%，两组最小等位基因（C等位基因）频率分别为14.55%和19.54%，经Hardy⁃Weinberg遗传平衡定律检验，其等位基因在病例组及对照组人群中的分布符合遗传平衡，说明样本具有群体代表性。两组基因型与等位基因频率差异均无统计学意义（P〉0.05）；rs17782313位点各基因型间代谢指标（FBG、TC、TG、HDL⁃C和LDL⁃C）无显著差异。结论MC4R基因rs17782313位点多态性与广西壮族儿童单纯性肥胖无关。

［关键词］黑素皮质素；基因多态性；单纯性肥胖；壮族

作者单位：1.广西柳州市妇幼保健院医学遗传科，广西，柳州545001
2.柳州市红十字会医院检验科，广西，柳州545001
3.广西柳州市妇幼保健院儿保科，广西，柳州545001
4.广西科技大学第一附属医院体检科，广西，柳州545002

儿童肥胖现象愈发严重，已逐渐成为社会关注的健康问题。流行病学研究发现，我国儿童单纯性肥胖率高达7.2%，接近欧美发达国家水平［1］。肥胖是由环境和遗传因素共同作用而发生的，但目前越来越多的证据表明，遗传因素在肥胖的发生发展中起着重要的作用［2］。肥胖发生的机制主要是由于体内能量失衡所导致的，MC4R基因编码的蛋白在调节体内能量平衡上发挥着重要作用［3］，并且被认为与体重指数（body mass index，BMI）密切相关［4］，2008年全基因组关联分析（ge⁃nome⁃wide association study，GWAS）发现MC4R基因多态性位点rs17782313与成人和儿童肥胖有明显的关联［2］。基于以上结论，本文以广西壮族儿童为研究对象，探讨黑素皮质素基因MC4R基因rs17782313位点多态性与广西壮族儿童肥胖及其代谢指标的关系，旨在从分子生物学角度探讨肥胖在广西壮族人群中的遗传机制。

1　资料与方法

1.1一般资料

2014年4月～2014年12月选取柳州市中小学壮族儿童285人，儿童单纯性肥胖诊断标准：超过同身高同性别参照人群标准体质量的20%者定为单纯性肥胖儿童［1］。肥胖组151例，其中男性111例，女性40例，平均年龄13.31±4.13岁；健康对照组134例，其中男性63例，女性71例，平均年龄13.20±2.57岁。两组儿童均未服用激素与影响脂代谢的药物。本研究经得研究对象父母同意，并获得医院医学伦理委员会的批准。

1.2方法

1.2.1BMI及代谢指标测定

两组儿童于相同条件下按照标准方法测量身高和体重，根据公式BMI=W（kg）/H（m2）计算BMI，其中W代表体重，单位为kg，H代表身高，单位为m。抽取所有研究对象清晨空腹静脉血，分离血清，测定空腹血糖（serum fasting glucose，FBG），胆固醇（cholesterol，TC），甘油三酯（triglyc⁃eride，TG），高密度脂蛋白（high⁃density lipoprotei，HDL⁃C）及低密度脂蛋白（low⁃density lipoprotein，LDL⁃C），以上测定都在全自动生化分析以上进行。全部测定由专人负责在固定的仪器上进行，并进行质控。同时抽取2 mL静脉血予乙二胺四乙酸二钠（EDTA⁃Na2）抗凝，酚氯仿法提取全基因组DNA，标本-80℃保存，用于基因分析。

1.2.2基因多态性检测

使用SNaPshot技术，在ABI3730XL型DNA序列检测仪（ABI，美国）平台上，结合软件GeneMap⁃per 4.0分析完成对MC4R基因rs17782313位点单核苷酸多态性的基因分型检测。该位点PCR扩增正向引物为F：5′AGGCTCTGCTCTGTGTCTCTT 3′，反向引物为R：5′CTTCTGGAGGCAGGTTCT⁃GT3’。SNaPshot反应过程中延伸引物序列为：5′tttttttttttttttttttttttttttttttttTAAAGCAGGAGAGATTGT ATCC 3′，PCR反应体系为20 μ L，包括10×PCR缓冲液（Mg2+free，invitrogen，美国）2 μ L，dNTP混合物0.5 μ L（10 mmol/L，Takara，日本），0.8 μ L MgCl2（50 mmol/L，invitrogen，美国），Platinum Taq DNA聚合酶0.2 μ L（5U，invitrogen，美国），PCR正向和反向引物（10 pmol/L）各0.5 μ L和1 μ L DNA模板（20 mg/L）。PCR反应程序：95℃变性2 min；94℃变性20 s，56℃退火30 s，72℃延伸40 s，33个循环；最后72℃延伸5 min，结束后4℃保存。PCR产物经过纯化处理后，在ABI3730XL型DNA序列检测仪上进行毛细管电泳，运行GeneMapper 4.0软件分析实验结果。

1.2.3统计学方法

2　结果

2.1一般情况

肥胖组151例，其中男性111例，女性40例，平均年龄13.31±4.13岁，平均BMI值27.48±4.03 kg/m2；正常组134例，其中男性63例，女性71例，平均年龄13.20±2.57岁，平均BMI值18.88±2.50 kg/m2。BMI值在组间的差异有统计学意义（t= 31.471，P〈0.05），以肥胖组的BMI为高。肥胖组与正常组间男女人数的构成比有统计学差异（P〈0.05），肥胖组中的男性明显多于正常组，女性明显少于正常组，在该年龄段人群中男性肥胖率为63.79%（111/174），女性为36.04%（40/111），结果见表1。

表1　研究对象的一般情况Table 1 The general condition of the research object

在代谢参数上，血糖、甘油三酯、总胆固醇、高密度脂蛋白和低密度脂蛋白各指标在组间差异均有统计学意义（P〈0.05），结果见表2。

表2　肥胖组与对照组代谢指标的比较Table 2　 The metabolism indices between the obesity group and the control group

2.2MC4R基因rs17782313位点基因型及等位基因型频率在肥胖组和正常对照组的比较

健康对照组和肥胖组MC4R基因rs1778231 3CC型、CT型及TT型基因型频率分别为1.49%、26.11%、72.39%和3.31%、32.45%、64.24%，等位基因C、T频率分别为14.55%、85.45%和19.54%、80.46%，经Hardy⁃Weinberg遗传平衡定律检验，其等位基因在病例组及对照组中的分布符合遗传平衡，说明样本具有群体代表性。肥胖组的BMI显著高于健康对照组，差异有统计学意义（P〈0.05），然而引起这一差异的原因与MC4R基因rs17782131位点多态性没有关联（P〉0.05）。具体结果见表3。

表3　肥胖组和对照组MC4R基因rs17782313位点基因型和等位基因频率n（%）Table 3　 The frequencies of genotype and allele of MC4R gene rs17782313 in the obesity group and the control group［n（%）］

2.3MC4R基因rs17782313位点多态性与肥胖代谢指标间的相关性

MC4R基因rs17782313位点CC、CT、TT基因型与各代谢参数血糖、总胆固醇、甘油三酯、高密度脂蛋白和低密度脂蛋白间的差异无统计学意义（表4）。

表4 　MC4R SNP rs17782313位点不同基因型肥胖相关代谢组分比较Table 4 Analysis genotype and metabolism indices at the SNP rs17782313 of gene MC4R

3　讨论

MC4R基因是黑素皮质素受体家族成员之一，由下丘脑腹侧核分泌，是一个调节能量平衡的重要信号分子，在控制饮食和机体质量稳态中起关键作用［5］。MC4R基因定位于人类基因组第18号染色体长臂（18q22），至全基因组关联分析发现MC4R基因rs17782313多态性位点与肥胖密切相关以后，近年来国内外有很多关于该位点与肥胖关系的研究。Renstrom等［6］在对4 923例瑞典北部成年人的GWAS研究中再一次证明了rs17782313位点与肥胖相关联。然而在随后的研究中却出现了不一致的结论。Ng等［7］科学家在对7 705个中国人12个易感基因的14个多态性位点发现MC4R基因的rs17782313位点与肥胖并无显著相关性。而同一年Cheung等［8］科学家报告了该多态性位点与肥胖显著相关。日本科学家Katsuura⁃Kamano等［9］在2 035例日本人队列研究中也证明了MC4R基因的rs17782313位点与肥胖无显性关系。本研究在利用SNaPshot技术分析的基础上，分别分析了广西壮族儿童肥胖组和对照组MC4R基因rs17782313位点基因型，结果发现MC4R基因rs17782313多态性位点基因型CC、CT、TT的构成比以及等位基因频率在肥胖组和健康对照组中均无显著差异（P〉0.05），结果与与日本科学家一致。在代谢指标的研究中，各基因型组的血糖、总胆固醇、甘油三酯、高密度脂蛋白及低密度脂蛋白之间并没有显著差异（P〉0.05），说明MC4R基因rs17782313位点多态性与机体代谢无直接联系。而这一结论也得到了Yilmaz等［10］科学家的证实，Ho⁃Urriola等［11］科学家也得出了相同的结论，MC4R基因rs17782313多态性位点在对于儿童肥胖的贡献上主要是通过影响情绪，食欲以及进食缺少饥饿感等行为上去影响肥胖的发生。本次研究发现肥胖组中男女比例与对照组中男女比例存在着很大的差异（P〈0.05），肥胖组中男性儿童青少年明显高于正常组，而女性少于正常组。肥胖在男性中的比率明显高于女性，呈现出男高女低的特点，这一特点与国内研究一致［12］，但其产生的原因尚不完全清楚。MC4R基因rs17782313位点多态性在肥胖组与正常组中差异无统计学意义，考虑为青少年儿童正处于身体发育阶段，随着年龄的增长差异会越发显著，此外环境的因素也可能掩盖或减弱基因的作用。不同地域，不同人群，不同饮食习惯上都存在着差异也影响着研究结果。

综上所述，本研究中显示MC4R基因rs17782313位点多态性位点与广西壮族儿童肥胖及各代谢指标无显著联系。分析可能原因主要是基因多态性位点存在着种族和地域的差异，肥胖的发生发展是众多易感基因及环境因素相互作用的结果。基因的多态性与肥胖的关系还参杂着环境因素和生活行为等因素的交互作用，某个位点变异的效应可能被其他基因或环境效应所修饰，这些都需要通过扩大样本规模提高检验效能才能得出的更有意义的结论。

参考文献

［1］全国儿童期单纯肥胖症研究协作组，中国疾病预防控制中心妇幼保健中心.全国0～6岁儿童单纯性肥胖流行病学研究［J］.中华儿科杂志，2008，46（3）：179-184.

［2］Loos RJ，Lindgren CM，Li S，et al. Common variants near MC4R are associated with fat mass，weight and risk of obesity［J］. Nat Genet，2008，40（6）：768-775.

［3］Balthasar N，Dalgaard LT，Lee CE，et al. Divergence of melanocortin pathways in the control of food intake and energy expenditure［J］. Cell，2005，123（3）：493-505.

［4］Corella D，Ortega⁃Azorin C，Sorli JV，et al. Statistical and biological gene⁃lifestyle interactions of MC4R and FTO with diet and physical activity on obesity：new ef⁃fects on alcohol consumption［J］. Plos One，2012，7 （12）：e52344.

［5］Pott W，Albayrak O，Hinney A，et al. Successful treat⁃ment with atomoxetine of an adolescent boy with atten⁃tion deficit/hyperactivity disorder，extreme obesity，and reduced melanocortin 4 receptor function［J］. Obes Facts，2013，6（1）：109-115.

［6］Renstrom F，Payne F，Nordstrom A，et al. Replication and extension of genome⁃wide association study results for obesity in 4923 adults from northern Sweden［J］. Hum Mol Genet，2009，18（8）：1489-1496.

［7］Ng MC，Tam CH，So WY，et al. Implication of genet⁃ic variants near NEGR1，SEC16B，TMEM18，ETV5/ DGKG，GNPDA2，LIN7C/BDNF，MTCH2，BC⁃DIN3D/FAIM2，SH2B1，FTO，MC4R，and KCTD15 with obesity and type 2 diabetes in 7705 Chinese［J］. J Clin Endocrinol Metab，2010，95（5）：2418-2425.

［8］Cheung CY，Tso AW，Cheung BM，et al. Obesity sus⁃ceptibility genetic variants identified from recent ge⁃nome⁃wide association studies：implications in a chi⁃nese population［J］. J Clin Endocrinol Metab，2010，95 （3）：1395-1403.

［9］Katsuura⁃Kamano S，Uemura H，Arisawa K，et al. A polymorphism near MC4R gene（rs17782313）is associ⁃ated with serum triglyceride levels in the general Japa⁃nese population：the J⁃MICC Study［J］. Endocrine，2014，47（1）：81-89.

［10］Yilmaz Z，Davis C，Loxton NJ，et al. Association be⁃tween MC4R rs17782313 polymorphism and overeating behaviors［J］. Int J Obes（Lond），2015，39（1）：114-120.

［11］Ho⁃Urriola J，Guzman⁃Guzman IP，Smalley SV，et al. Melanocortin⁃4 receptor polymorphism rs17782313：as⁃sociation with obesity and eating in the absence of hun⁃ger in Chilean children［J］. Nutrition，2014，30（2）：145-149.

［12］罗飞宏，沈飞仙，屠月珍，等.上海市6～18岁少儿肥胖患病率调查［J］.中华糖尿病杂志，2004，12（6）：427-429.

Relationship between SNP rs17782313 variation in MC4R gene and obesity in zhuang nationality children

TANG Ning1，CHEN Yidan2，ZENG Ting3，QIN Zhengxue4，YAN Tizhen1，LUO Shiqiang1，LI Wugao1，LI Jingwen1，WANG Qiuhua1，LI Zhetao1
（1. Department of Medical Genetics，Liuzhou Municipal Maternity and Child Healthcare Hospital，Liuzhou，Guangxi，China，545001；2. Clinical Laboratory，Liuzhou Red Cross hospital，Liuzhou，Guangxi，China，545001；3. Department of Child Health，Liuzhou Municipal Maternity and Child Healthcare Hospital，Liuzhou，Guangxi，China，545001；4.Department Of Medical Examination，The First Affiliated Hosipital of Guangxi Medical University，Liuzhou，Guangxi，China，545002）

［ABSTRACT］Objective To explore the relationship between the single nucleotide polymorphisms (SNP) rs17782313of the M4CR gene and simple obesity in children of the Zhuang nationality. Methods 285 children (151 cases of simple obese children and 134 healthy control children) in Liuzhou were enrolled. Height and bodyweight were measured. Serum fasting glucose (FBG), cholesterol (TC), triglyceride (TG), high⁃density lipoprotein (HDL⁃C) and low⁃density lipoprotein (LDL⁃C) were measured, and SNP rs17782313 singlebook=2,ebook=29nucleotide polymorphisms of MC4R gene were detected by SNaPshot assay. Results The CC, CT and TT genotype frequencies of rs17782313 polymorphism in normal control group and simple obesity group were 1.49% , 26.11% , 72.39% and 3.31% , 32.45% , 64.24% , respectively. Minor allele frequencies (C allelic frequency) in the simple obesity group and the normal control group were 14.55%, and 19.54%, respectively. SNP rs17782313 of the MC4R gene were found in Hardy⁃Weinberg equilibrium. The genotype and allelic frequencies of rs17782313 and metabolic parameters (FBG, TC, TG, HDL⁃C and VDL⁃C) in simple obese children were not significantly different from those in controls (P〉0.05). Conclusions rs17782313 polymorphisms of MC4R gene are not associated with simple obesity in Chinese Zhuang preschool children in Liuzhou of Guangxi province.

［KEY WORDS］MC4R；Genetic polymorphism；Simple obesity；Zhuang nationality

基金项目：中国疾病预防控制中心妇幼保健中心合生元母婴营养与健康研究项目（2012FY009）；广西壮族自治区卫生厅自筹课题（Z2013602）

通讯作者：李哲涛，E⁃mail：48217306@qq.com