高效hCu，Zn⁃SOD⁃PTD融合蛋白的表达及其穿膜功能的研究

王晓勋杞少华李瑞明2梁清乐



高效hCu，Zn⁃SOD⁃PTD融合蛋白的表达及其穿膜功能的研究

王晓勋1杞少华1李瑞明2梁清乐1

［摘要］目的探讨hCu，Zn⁃SOD⁃PTD融合蛋白的表达及其穿膜功能。方法首先，人工设计合成蛋白转导域序列（protein transduction domain，PTD），以人胚肝组织的总RNA为模板，逆转录扩增得人铜锌超氧化物歧化酶全长cDNA序列。其次，将此序列及人工合成PTD序列定向插入pET16b载体；测序鉴定后，将构建成功的重组载体导入E. coli BL21菌株，异丙基⁃β⁃d⁃硫代半乳糖苷（isopropyl⁃β⁃d ⁃thiogalactoside，IPTG）诱导表达，经镍柱纯化，洗脱液经SDS⁃PAGE检测。最后，将纯化产物与食管癌细胞（EC9706）共孵育，用激光共聚焦和流式细胞仪的方法检测蛋白穿膜能力及活性。结果测序结果与人铜锌超氧化物歧化酶全长cDNA序列相符；SDS⁃PAGE结果出现18.6 kd和20 kd的目的条带；激光共聚焦和流式细胞仪的方法显示蛋白可穿膜且保持活性。结论本实验成功构建了PET16b/hCu，Zn ⁃SOD⁃PTD原核表达质粒，可在大肠杆菌中稳定表达融合蛋白，融合蛋白具有穿膜且保持活性。

［关键词］蛋白转导域；人铜锌超氧化物歧化酶；生物膜；原核表达载体；内化作用

作者单位：1.湖北医药学院附属太和医院检验部，湖北十堰442000
2.湖北医药学院附属太和医院生物医学研究所，湖北十堰442000

人铜锌超氧化物歧化酶（human Cu/Zn⁃super⁃oxide dismutase，hCu，Zn⁃SOD）是人体内清除超氧阴离子自由基的专一高效的酶类，能保护细胞和组织免受氧应激反应的损伤，具有抗衰老、抗辐射、抗癌和抗炎作用。但是人铜锌超氧化物歧化酶属于大分子蛋白，在哺乳动物细胞膜和皮肤上没有专一受体［1］，所以外源性的人铜锌超氧化物歧化酶难以进入细胞和组织内发挥生物学作用，限制了其在疾病预防、治疗或美容等多领域的应用。

蛋白转导现象的发现为外源性人铜锌超氧化物歧化酶的临床应用开拓了广泛的前景。此现象最初在对人类免疫缺陷型病毒的HIV⁃1反式激活蛋白研究中发现。1988，Green等［2-3］首次报道了HIV⁃1的反式激活蛋白TAT具有内化功能。从HIV⁃1病毒体内分离的TAT调控基因编码32个～57个氨基酸的中心区域和碱性氨基酸富集区可以有效地穿越细胞膜。随后发现，TAT蛋白真正具有转导作用的是其序列中的47～57这11个氨基酸残基，称之为蛋白转导域（protein transduction do⁃min，PTD）［4］。进一步研究发现蛋白转导结构域不仅存在于HIV⁃1反式激活蛋白中，如单纯疱疹病毒和果蝇VP22转录因子的同源框转录蛋白触足的研究中也发现有富含精氨酸残基PTD序列［5］。近年来随着生物信息技术和PTD跨膜转运机制研究的发展，许多国内外研究者对人工设计比天然PTD具有更高转导效率的蛋白转导活性肽进行了探索。由国外科学家设计的9个精氨酸或9个赖氨酸残基构成的基序，显示出了比TAT更强的蛋白转导活性［6］；研究人员通过优化空间结构和表面的电子分布也设计出了多种具有更强跨膜活性的蛋白转导域［7］。随着对PTD分子作用机制深入，人们利用此项技术合成更多具有穿膜活性的融合蛋白分子来解决大分子蛋白不能跨越生物膜来发挥其生物活性这一难题［5，7-10］。本文依据上述文献中的原理、参考文献设计出高效蛋白质转导域用于本实验。

本研究旨在构建具有高效转导域的PET16b/ hCu，Zn⁃SOD⁃PTD原核表达载体，在大肠杆菌表达、制备和纯化蛋白hCu，Zn⁃SOD⁃PTD融合蛋白，并检测目的蛋白穿透哺乳动物细胞的能力，为外源性的人铜锌超氧化物歧化酶的临床应用奠定良好的基础。

1　材料和方法

1.1材料

1.1.1质粒、菌种、细胞和动物

PGEM⁃T载体购自美国Promaga公司；pET⁃16b、E. coli BL21（DE3）购于德国Novagen公司；食管癌细胞株（EC9706）、JM109菌株皆由太和医院生命科学研究所保存。

1.1.2主要试剂

Trazol试剂购自美国Gibicol公司；逆转录试剂盒购自芬兰Finnzymes公司；限制性内切酶购自美国New England公司；T4连接酶、高保真Taq酶、普通Taq酶购自美国Stratagene公司；质粒提取试剂盒与胶回收纯化试剂盒购自美国Promaga公司；荧光探针2′，7′⁃二氯荧光黄双乙酸盐（2′，7′⁃di⁃chlorofluorescin diacetate，DCFH⁃DA）购自上海碧云天生物技术有限公司；异丙基⁃β⁃d⁃硫代半乳糖苷（isopropyl⁃β⁃d⁃thiogalactoside，IPTG）购自荷兰Duchefa公司；兔抗组氨酸抗体购自美国Sigma公司；层析柱购自德国Qiagen公司；其余试剂均进口或国产分析纯级。

1.1.3 PCR引物

从GenBank中查取序列号为X02317［1］的人铜锌SOD全长编码序列（coding sequence，CDS）设计扩增人铜锌SOD全长CDS引物，引物1：5′⁃CCGCTC GAGGCGACGAAGGCCGTGTGCGTG⁃3′（含XhoI酶切位点），引物2：5′⁃CGGGATCCTATTATTGGG CGATCCCAATTAC⁃3′（含BamHI酶切位点）；PTD的寡核苷酸序列为：5′⁃TATGACCTATGCGCGT GCGGCAGCGCGTCAGGCTCGTGCCC⁃3′，5′⁃TC GAGGGGCACGAGCCTGACGCGCTGCCGCACG CGCATAGGTCA⁃3′（含Ndel、XhoI限制性内切酶位点）。以上序列均委托上海生工生物工程股份有限公司合成。

1.2方法

1.2.1PTD序列的设计

根据PTD多肽跨膜结构域的特点，并参考文献［7-9］，利用软件设计具有高效跨膜活性的蛋白结构域：YARAAARQARAL，并设计简并寡核苷酸序列：5′⁃TATGACCTATGCGCGTGCGGCAGCGC GTCAGGCTCGTGCCC⁃3′，5′⁃TCGAGGGGCAC GAGCCTGACGCGCTGCCGCACGCGCATAGGT CA⁃3′。

1.2.2人铜锌SOD全长cDNA序列的获得及鉴定

提取人胚胎肝脏组织的总RNA，以其为模板用于人铜锌SOD全长CDS的逆向转录和扩增，将获得的人铜锌SOD全长CDS片段，加腺嘌呤（A）处理纯化后插PGEM⁃T载体，以获得PGEM⁃hCu/ Zn⁃SOD克隆载体。

1.2.3 PET/hCu，Zn⁃SOD原核表达载体的构建

用限制性内切酶XhoI、BamHI双酶切上面获得的pGEM⁃hCu/Zn⁃SOD载体，获得两端带有粘性末端的双链全长hCu/Zn⁃SOD CDS片段，同时用同样的酶对pET⁃16b空载体进行双酶切。胶回收两端带有粘性末端的线性载体及hCu/Zn⁃SOD全长CDS片段，将hCu/Zn⁃SOD CDS片段定向插入经酶切回收的大片段PET⁃16b空载体，以获得PET/ hCu，Zn⁃SOD原核表达载体。

1.2.4 PET/hCu，Zn⁃SOD⁃PTD原核表达载体的构建

对上述获得的PET/hCu，Zn⁃SOD原核表达载体用限制性内切酶Ndel、XhoI进行特异性酶切，胶回收获得胶回收两端带有粘性末端的线性载体。对根据PTD设计的2条简并寡核苷酸序列进行高特异性性退火杂交，选择逐渐降温的实验方法获得人工合成的两端带有Ndel、XhoI限制性内切酶粘性末端的小片段简并双链DNA序列，插入PET⁃16b上述线性载体，以获得PET/hCu，Zn⁃SOD⁃PTD原核表达载体。用T7引物对载体克域测序，测序结果与GENEBANK X02317 CDS进行比对，鉴定插入片段与上叙片段的一致性。

1.2.5目的蛋白的诱导表达与纯化

PET⁃hCu，Zn⁃SOD原核表达载体与PET⁃PTD⁃hCu，Zn⁃SOD原核表达载体分别导入感受态E.coli BL21（DE3）中，挑选阳性克隆至50 mL含氨苄青霉素（100 mg/L）的Luria⁃Bertani培养液中（LB培养基），于37℃扩增培养。当细菌生长至OD600为0.6时，加入0.1 mol/L IPTG至终浓度1 mmol/L，置25℃诱导培养过夜。然后收集菌体，超声裂菌，获得上清。把上清缓慢通过Ni2+亲和层析柱对目的蛋白进行纯化，分别得到His⁃Tag⁃hCu，Zn⁃SOD和His⁃Tag⁃hCu，Zn⁃SOD⁃PTD 2种融合蛋白，纯化蛋白经SDS⁃PAGE鉴定。蛋白定量后，储存于70℃冰箱内。

1.2.6 hCu，Zn⁃SOD⁃PTD蛋白穿透细胞膜能力实验

EC9706细胞用含10 %小牛血清（fetal bovine serum，FBS）的RPMI 1640培养液（添加链霉素和青霉素的终浓度均为1 000 U/mL）于5% CO2、37℃培养。细胞接种于6孔板中，在含10% FBS的1640培养基中培养48 h后，再在6孔中分别加入2 mmol/L 的hCu，Zn⁃SOD 20 μL，2 mmol/L的hCu，Zn⁃SOD⁃PTD 5 μL、10 μL、15 μL、20 μL及不含血清的1640培养基20 μL，37℃放置15 min后，每孔各加入荧光探针DCFH⁃DA作用5 min，然后用PBS洗涤3次，立即置于荧光相差显微镜观察结果，或胰酶消化后悬浮于PBS中进行流式细胞荧光检测。

1.2.7统计学方法

2　结果

2.1重组PET/hCu，Zn⁃SOD⁃PTD原核表达载体的构建及鉴定

PET/hCu，Zn⁃SOD⁃PTD载体克隆区经T7引物测序部分结果见图1，结果显示插入片段与上述GENEBANK X02317 CDS片段一致、未发现变异。重组原核表达载体的鉴定中，hCu，Zn⁃SOD⁃PTD质粒经NdeI/BamH双酶切后电泳图见图2。

2.2表达后细菌的蛋白提取物和融合蛋白纯化后的SDS⁃Page分析

PET/hCu，Zn⁃SOD⁃PTD和PET/hCu，Zn⁃SOD重组质粒分别转化E. coli BL21（DE3）后，在IPTG诱导下产生目的融合蛋白，目的蛋白再经镍柱纯化。以融合蛋白纯化后产物进行SDS⁃PAGE分析，结果显示分别在18.6 kd和20 kd出现目标表达条带，与hCu，Zn⁃SOD⁃PTD和hCu，Zn⁃SOD融合蛋白的分子量相符，结果见图3。SDS⁃PAGE的结果表明本实验所构建的原核表达载体在大肠杆菌中能够稳定而高效地分别表达hCu，Zn⁃SOD和hCu，Zn⁃SOD⁃PTD融合蛋白（图4）。

2.3hCu，Zn⁃SOD⁃PTD融合蛋白作用于人食管癌细胞EC9706

将hCu，Zn⁃SOD⁃PTD、hCu，Zn⁃SOD与食管癌细胞共孵育15 min后，再加入荧光探针DCFH⁃DA，用激光共聚焦显微镜和流式细胞仪检测细胞内的DCF的荧光。由图5至图8可见，与空白对照组相比，hCu，Zn⁃SOD组的荧光强度无明显变化（P 0.05），而hCu，Zn⁃SOD⁃PTD融合蛋白组的荧光强度明显减弱，组间P〈0.05，hCu，Zn⁃SOD⁃PTD融合蛋白不同浓度组间比较P〈0.05，不同浓度hCu，Zn⁃SOD⁃PTD组间荧光值均数随浓度的增加而减少。有明显的浓度依赖性，间接提示hCu，Zn⁃SOD⁃PTD融合蛋白可穿透细胞膜且保持生物学活性。

3　讨论

人铜锌超氧化物歧化酶是细胞内一种重要的防御氧化应激的蛋白酶，它不但在家族性肌萎缩性侧索硬化症、帕金森病、登革热、癌症、白内障和多种神经紊乱综合征中具有重要的生理学意义和治疗潜力，而且在食品和化妆品业中也具有广阔的前景［10］。但是外源性的人铜锌超氧化物歧化酶难以被人体吸收，使之在应用方面收到了很大限制。本实验中采用了一种新的方法来解决这一问题，即在人铜锌超氧化物歧化酶的多肽链前添加一段具有跨膜转送功能的短肽——PTD。

研究表明，PTD含丰富的碱性和疏水氨基酸的序列，其跨膜运转的能力的大小与碱性氨基酸的序列和疏水氨基酸比例及其排列的空间构像和多肽表面正电子的分布有关［11-13］。因此在TAT⁃PTD的基础上，通过改变碱性氨基酸的分布与序列，就可以使得融合蛋白的转导效率显著提高。利用这些携带有PTD和效应蛋白表达融合蛋白解决了大分子蛋白无法穿透细胞膜而发挥正常的生物活性这一难题，这一技术已经是用于多种蛋白的跨膜实验中［4-9］。现代蛋白结构分析软件为模拟、筛选蛋白转导域序列提供了便捷的工具。如Ho等［12］就应用生物信息学软件，通过改变结构域中疏水氨基酸和碱性氨基酸的种类和分布、优化表面电子分布，人工设计出比TAT⁃PTD具有更高效率的穿膜活性的PTD分子。在该研究中，利用软件设计新的PTD序列，由11个氨基酸组成，序列为YARAAARQAR（Q）A，根据软件计算，此序列的穿膜效率是天然TAT⁃PTD的33倍［12］。

本研究利用基因工程的方法得到了hCu，Zn⁃SOD⁃PTD融合蛋白。首先构建PET16b/hCu，Zn⁃SOD和PET16b/hCu，Zn⁃SOD⁃PTD 2种重组原核表达载体。在人工设计合成的PTD序列的末端加上Ndel酶切位点的序列，与此同时通过双酶切反应在人铜锌超氧化物歧化酶全长cDNA序列的末端也得到一个Ndel酶切位点的序列，两者通过连接酶连接，就得到hCu，Zn⁃SOD⁃PTD的全长cD⁃NA序列。由于选用了PET16b作为原核表达载体，使表达的2种蛋白的N段含有连续的10个his标签融合序列，就可方便快捷利用Ni2+柱层析进行纯化。纯化后洗脱液的SDS⁃PAGE结果表明，2种载体可以高效稳定表达2种蛋白。

荧光探针DCFH⁃DA是进行活性氧检测的有效方法。DCFH⁃DA本身没有荧光，可以自由穿过细胞膜，且被细胞内的活性氧氧化为有荧光的2′，7′⁃二氯荧光黄（dichlorofluorescin，DCF）。检测DCF的荧光就可以知道细胞内活性氧的水平。

本实验为检测目的融合蛋白透过细胞膜的能力，将hCu，Zn⁃SOD⁃PTD、hCu，Zn⁃SOD与食管癌细胞共孵育15 min，用DCF法检测了细胞内的荧光强度，荧光强度越弱，说明细胞内SOD的活性越强。荧光共聚焦显微镜和流式细胞仪的检测结果显示，与空白对照组相比，经过hCu，Zn⁃SOD蛋白处理的细胞内荧光值无明显变化P〉0.05，而hCu，Zn⁃SOD⁃PTD蛋白处理组的细胞内荧光强度明显减弱组间P〉0.05。与对照组hCu，Zn⁃SOD荧光值比较P〉0.01。这就间接提示hCu，Zn⁃SOD⁃PTD蛋白能有效快捷地穿过EC9706细胞膜清除氧自由基保持生物学活性，在特定浓度范围内，融合蛋白浓度与细胞内荧光强度成反比。本实验所设计并添加在目的蛋白前的PTD序列不仅可帮助蛋白跨膜转运，而且不影响目的蛋白发挥生物学活性。而hCu，Zn⁃SOD蛋白处理组由于细胞表面缺乏SOD特异性受体，外源性SOD无法进入细胞内，其荧光强度值与空白对照没有明显的变化。此外，用不同浓度的hCu，Zn⁃SOD⁃PTD融合蛋白处理细胞相同时间后，细胞内的荧光强度均值随着浓度的增加而减少，显示hCu，Zn⁃SOD⁃PTD融合蛋白透过细胞膜及清除氧自由基的作用具有浓度依赖性。

本研究依赖于生物信息学蛋白结构和跨膜蛋白结构的原理设计合成理论上具有高效穿膜活性的PTD结构和hCu，Zn⁃SOD⁃PTD融合表达，经过实验显示良好的穿膜能力，进一步提高了PTD分子的内化作用。为建立一种高效的PTD分子打下了良好的基础，建立了一种成本低、且能稳定表达的原核表达载体。由于PTD分子的高效穿膜活性使得细胞表面没有受体的hCu，Zn⁃SOD⁃PTD能更有效率的进入细胞内发挥其应有的生物学活性，也预示可以通过优化PTD结构把缺少穿越细胞膜的蛋白高效率的穿越细胞生物膜来发挥其生物活性。

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论著

Study on expression and trans⁃membrane activity of human Cu，Zn⁃SOD⁃PTD

WANG Xiaoxun1，QI Shaohua1，LI Ruiming2，LIANG Qingle1
（1. Inspection Department of Taihe Hospital，Hubei University of Medicine，Shiyan，Hubei，442000；
2. Biomedical Institute of Taihe Hospital，Hubei University of Medicine，Shiyan，Hubei，442000）

[ABSTRACT]Objective To study the expression and trans⁃membrane activity of human Cu, Zn⁃SOD⁃PTD. Methods First, protein transduction domain (PTD) sequence was designed and synthesized. Human Cu, Zn⁃SOD was amplified by reverse transcription PCR using the complete RNA of human embryonic liver as a template. Second, hCu, Zn⁃SOD gene and PTD sequence were inserted into pET16b plasmid. Then the recombinant plasmids were transformed into E. coli BL21 after sequencing identification. After being induced by isopropyl⁃β⁃d⁃thiogalactoside(IPTG), the fusion proteins were purified by nitrilotriacetic acid sepharose and the results were determined by SDS⁃PAGE. Third, the fusion proteins were co⁃cultured with the EC9706 cells and the trans⁃membrane activity was tested by laser scanning confocal microscopy and flow cytometer. Results The sequencing results were consistent with the full length cDNA sequence of hCu, Zn⁃SOD, and the results of SDS⁃PAGE showed 18.6 kd and 20 kd bands. The results oflaser scanning confocal microscopy and flow cytometer showed that the fusion proteins could be transduced into EC9706 cells and were enzymatically active. Conclusion Recombinant PET16b plasmids containing hCu, Zn⁃SOD⁃PTD gene were constructed successfully and fusion hCu, Zn⁃SOD⁃PTD proteins could be transduced into the cell membrane efficiently without the loss of enzymatic activity.

［KEY WORDS］Protein transduction domain（PTD）；Human Cu，Zn⁃SOD；Biomembrane；Prokaryotic expression vector；Internalization

基金项目：国家自然科学基金（81171783）

通讯作者：王晓勋，E⁃mail：524910@qq.com