葡萄糖⁃6⁃磷酸脱氢酶（G6PD）c.1311C〉T/IVS⁃1193T〉C与3′⁃UTR的多态性探讨

林芬　杨辉　吴教仁　杨立业



葡萄糖⁃6⁃磷酸脱氢酶（G6PD）c.1311C〉T/IVS⁃1193T〉C与3′⁃UTR的多态性探讨

林芬杨辉吴教仁杨立业

［摘要］目的对中国人群葡萄糖⁃6⁃磷酸脱氢酶（glucose⁃6⁃phosphate dehydrogenas，G6PD）c.1311C〉T/ IVS⁃11 93T〉C基因多态性与3′⁃非翻译区（3′⁃untranslated regions, 3′⁃UTR)的多态连锁相关性进行研究。同时了解粤东、华北地区健康人群中该突变基因的携带情况。方法应用全自动生化仪速率法测定G6PD活性，基因测序检测G6PD c.1311C〉T/ IVS⁃11 93T〉C基因多态性。根据G6PD基因UTR区设计特异性引物，测序确证携带c.1311C〉T/ IVS⁃11 93T〉C基因多态性的G6PD缺乏标本是否连锁有UTR单个碱基上的变异（single nucleotide polymorphisms，SNP）位点的变异。结果华南地区有39 例G6PD缺乏样本检测到携带c.1311C〉T/ IVS⁃11 93T〉C基因突变，其3′⁃UTR和5′⁃UTR端没有检测到SNP位点的变异。同时，我们研究发现G6PD酶活性正常的人群中也携带有c.1311C〉T/ IVS⁃11 93T〉C变异，其在潮州、梅州各100名正常人群中发生率分别为15.7%和12%，在郑州和石家庄各50名正常人群中发生率分别为2%和8%。该变异在中国南方与北方的正常人群之间相比较有统计学差异。粤东地区G6PD缺乏者中携带c.1311C〉T/ IVS⁃11 93T〉C基因突变的样本并未发现连锁有UTR SNP位点突变。结论关于G6PD c.1311C〉T/ IVS⁃11 93T〉C基因突变与G6PD缺乏之间的相关性值得进一步探讨。

［关键词］G6PD缺乏症；基因突变；UTR

作者单位：南方医科大学附属潮州市中心医院中心实验室，广东，潮州521021

葡萄糖⁃6⁃磷酸脱氢酶（glucose⁃6⁃phosphate de⁃hydrogenas，G6PD）缺乏症的发病原因主要是G6PD基因突变，导致G6PD酶活性降低，红细胞受氧化损伤而遭到破坏，引起溶血性贫血。临床表现高度异质性，其溶血的严重程度与剩余酶的功能呈负相关［1-3］。我们在临床研究中发现，粤东地区G6PD缺乏的病例中常发现2种静止突变，外显子c.1311C〉T和IVS⁃11 93T〉C显示出强连锁，而这种病例未发现其它外显子的突变。不久前，国外研究者指出c.1311C〉T和IVS⁃11 93T〉C2种静止突变与其下游非转录区的一个单个碱基上的变异（single nucleotide polymorphisms，SNP）位点连锁，这个位点的基因突变导致了基因表达（mRNA）降低［4］，从而引起G6PD缺乏。中国人群中携带c.1311C〉T/IVS⁃11 93T〉C突变的G6PD缺乏者是否也连锁有SNP位点的变异？目前无文献报告。另外，也有少数研究报道在G6PD正常的人群中也存在c.1311C〉T/ IVS⁃11 93T〉C基因多态性［5-7］，但是关于其在中国正常人群中的具体发生频率鲜见报道。针对以上2个方面，我们作了如下研究。

1　对象与方法

1.1研究对象

2014年6月至12月从广东省梅县妇幼保健院、平远县人民医院和兴宁县人民医院、揭阳普宁妇幼保健院以及潮州市中心医院体检中心收集的G6PD缺乏全血样本进行基因检测，并对其中39例携带有c.1311C〉T/ IVS⁃11 93T〉C基因多态性的样本进行非翻译区（untranslated regions, UTR) SNP位点检测。同时，我们收集南方潮州和梅县、北方郑州和石家庄（样本由上海凯普生物有限公司提供）G6PD正常人群全血样本进行G6PD c.1311C〉T/ IVS⁃11 93T〉C基因多态性检测。

1.2方法

1.2.1G6PD活性测定

参照《全国临床检验操作规程》介绍方法［8］，应用全自动生化仪速率法进行G6PD活性缺乏的筛查，酶活性低于5.3 U/L的样本诊断为G6PD缺乏。

1.2.2DNA提取

采用深圳亚能生物科技有限公司生产的DNA提取试剂盒提取DNA。

1.2.3c.1311C〉T以及IVS⁃11 93T〉C分型检测

膜反向斑点杂交法采用深圳亚能生物技术有限公司试剂盒，设计10对引物用于2号～13号外显子（包括外显子和外显子⁃内含子接合区）的扩增及基因测序。其中11号～12号外显子引物序列为：上游引物5′⁃GCAGTGGCATCAGCAAGA；下游引物3′⁃AGTGACGGGTGGAGGAGA。PCR反应条件：预变性95℃3 min；扩增94℃30 s，55℃30 s，72℃35 s，共35个循环。

1.2.45′⁃UTR和3′⁃UTR区域的扩增和测序

针对G6PD c.1311C〉T/ IVS⁃11 93T〉C基因突变样本，设计4对引物用于5′⁃UTR和3′⁃UTR区域的扩增和测序，分别是3′⁃UTR1引物：1F （GCAGACGAGCTGATGAAGA）和1R（GGAGT⁃GGGACAAGGAA GTG）（738 bp）；3′⁃UTR2引物：2F（TCACTCCAGCCCAACAGA）2R（GGTC CT⁃CAGGGAAGCAAA）（397 bp）；5′⁃UTR1引物：1F （AGGCGGGGAAACCGGACAGT）和1R（GTC CCCTTCGCTCTCGGGGT）（574 bp）；5′⁃UTR2引物：2F（ACCCCGAGAGCGAAG GGG AC）和2R （CGGCTGGGCATTGGGGAGTG）（330 bp）。

1.2.5测序结果分析

将测序序列用BLAST进行比对，同时对测序图谱应用Chromas软件直接分析，从而鉴定基因突变类型。DNA序列比对数据库：NCBI BLAST （httP：//www.nebi.nlm.nih.gov/BLAST/）。

1.2.6统计学分析

G6PD c.1311C〉T/ IVS⁃11 93T〉C基因多态性在中国南方与北方正常人群之间的比较采用SPSS 16.0专业版软件做χ2检验分析，以P〈0.05为有统计学意义。

2　结果

2.1c.1311C〉T/IVS⁃11 93T〉C的UTR区检测

我们对粤东地区人群进行G6PD缺乏症的流行病学调查研究［9］，此次选取了广东省潮州、揭阳普宁、梅县、平远、兴宁所检测出的39例携带c.1311C〉T/IVS⁃11 93T〉C基因多态性的G6PD缺乏样本，针对3′⁃UTR和5′⁃UTR的SNP位点设计引物并进行PCR扩增、测序，这些样本并未检测到SNP位点的变异，c.1311C〉T/IVS⁃11 93T〉C和3′⁃UTR测序图见图1。

2.2 G6PD正常人群的c.1311C〉T/ IVS⁃11 93T〉C基因多态性

我们分别对南方（潮州和梅州）和北方（郑州和石家庄）G6PD正常人群的c.1311C〉T/ IVS⁃11 93T〉C基因多态性进行调查，在潮州100名健康人群中检出15例（男6例，女9例），发生率为15%；在梅州100名健康人群中检出12例（男5例，女7例），发生率为12%。在郑州50名健康人群中仅发现1例，为男性，发生率是2%；而在石家庄50名健康人群中发现4例，均为女性，发生率是8%。经SPSS16.0专业版软件χ2检验分析，南方正常人群c.1311C〉T/ IVS⁃11 93T〉C发生率和北方正常人群相比较有统计学意义（P＝0.025）。人类基因计划组中有G6PDc.1311C〉T在不同国家正常人群中的分布频率（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov），其中欧洲、美国、非洲国家的分布频率分别为7.16%、12.39%和21.71%，但没有c.1311C〉T合并IVS⁃11 93T〉C基因多态性的数据。中国部分地区正常人群中G6PD c.1311C〉T/ IVS⁃11 93T〉C的发生率见表1。

表1　中国部分地区正常人群G6PD c.1311C〉T/ IVS⁃11 93T〉C的发生率Table 1 The frequency of G6PD c.1311C〉T/ IVS⁃11 93T〉C among healthy people in some parts of China

3　讨论

目前，世界范围内已报道190多种G6PD基因突变类型，中国人群中报道发现30多种［5］，几乎所有的突变都位于G6PD基因的编码区，且绝大部分为单个碱基置换的错义突变，但是仍有一些病例无法从经典的分子病理学知识中得到解答。

1989年，有研究者［10］发现G6PD c.1311C〉T突变是一个同义突变，不会造成G6PD氨基酸的替换，常与其它突变共存，在欧洲人中G6PD地中海型c.563 C〉T突变伴发c.1311C〉T，日本人中G6PD c.1264G〉A伴发c.1311C〉T。于国龙等［10］对广东省G6PD缺乏症的研究中发现，广东的G6PD缺乏症患者c.1311C〉T突变常伴发IVS⁃11 93T〉C突变，推测由于c.1311C〉T和IVS⁃11 93T〉C 2个位点相距较近，可能导致核内不均一RNA（heteroge⁃neous nuclear RNA，hnRNA）在形成成熟的mRNA过程中，核内的小核RNA（small nuclear RNA，snRNA）与11内含子的结合引起构象改变致使剪切位点改变，从而引起G6PD酶活性降低。我们在临床研究中发现，粤东地区的G6PD缺乏病例中c.1311C〉T和IVS⁃11 93T〉C这2种静止突变也常同时出现，而这种病例并没有发现其它外显子的突变。

国外有研究者对马来西亚原住民人群Negrito 的G6PD缺乏者的分子机制进行研究，在这些病例中发现了G6PD基因3′⁃UTR 3个位点的单核苷酸多态性（SNPs），包括rs112950723、rs111485003和rs1050757，单倍型c.1311C〉T/ IVS⁃11 93T〉C与rs1050757G强相关，推论rs1050757通过影响mRNA的稳定性和转录或者miRNA的调节过程，导致G6PD mRNA降解发生变化，从而致使G6PD缺乏［4］。我们推测中国人群中携带c.1311C〉T/IVS⁃11 93T〉C突变的G6PD缺乏者也可能连锁有SNP位点的变异，因此，我们将在广东、广西收集的39例携带有c.1311C〉T/ IVS⁃11 93T〉C突变的G6PD缺乏标本作为研究对象，针对3′⁃UTR和5′⁃UTR 的SNP位点设计引物并进行PCR扩增、测序。通过检测，39例携带c.1311C〉T/ IVS⁃11 93T〉C突变基因的G6PD缺乏者没有检测到UTR SNP位点的变异。c.1311C〉T/ IVS⁃11 93T〉C突变基因3′端rs1050757位点A到G转变在马来西亚原住民人群Negrito中导致酶缺乏有可能局限于本地，与Negrito系东南亚古老居民，长期相对封闭的原始生活环境有关。

c.1311C〉T/IVS⁃11 93T〉C基因突变在G6PD正常和缺乏的样本中均存在，在中国人群G6PD缺乏症患者中c.1311C〉T/ IVS⁃11 93T〉C突变的发生率约为5.1%～11.1%，在G6PD正常人群的发生率约为9.4%～18.4%［6］。王颖等［7］对海南黎族人群的研究中发现，在海南黎族男性G6PD缺乏和正常组中c.1311C〉T/ IVS⁃11 93T〉C突变发生频率分别为6.0%和24%。何永蜀等［5］研究显示云南彝族G6PD缺乏症患者和健康对照组c.1311C〉T/ IVS⁃11 93T〉C基因突变频率分别为18.3%和29.9%。我们此次在潮州和梅州G6PD正常人群中检测出的c.1311C〉T/ IVS⁃11 93T〉C突变的发生率分别为15%和12%，与以往文献的研究基本一致，由此可见c.1311C〉T/ IVS⁃11 93T〉C突变在粤东地区正常人群中普遍存在。多年来，我国学者对于G6PD缺乏症的研究大多来自南方各省，北方正常人群中是否也存在c.1311C〉T/ IVS⁃11 93T〉C基因突变没有文献报道。我们收集了石家庄、郑州各50名健康人群样本进行检测，发现4例c.1311C〉T/ IVS⁃11 93T〉C突变基因，由此可见该突变点在北方正常人群中也存在，只是发生率明显降低。

c.1311C〉T/ IVS⁃11 93T〉C为一古老突变，它可能在长期的群体传递过程中与其它G6PD突变基因发生交叉，我们认为不完全排除该突变点多态性变异与酶缺陷有关的可能，粤东地区c.1311C〉T/ IVS⁃11 93T〉C基因突变的G6PD缺乏样本是否还受其他影响酶活性表达的基因调控？我们将对此进一步研究和分析。

参考文献

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［8］叶应妩，王毓三，申子瑜.全国临床检验操作规程［M］.第3版.南京：东南大学出版社，2006：175-178.

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［10］于国龙，蒋玮莹，杜传书，等.葡萄糖⁃6⁃磷酸脱氢酶cDNA 1311 C T复合11内含子93T C突变［J］.中华血液学杂志，2004，25：610-612.

论著

The investigation of polymorphism on G6PD c.1311C＞T/IVS⁃1193T＞C and 3′⁃UTR（untranslated re⁃gions）

LIN Fen，YANG Hui，WU Jiaoren，YANG Liye
（Central Laboratory，Affiliated Chaozhou Central Hospital，southem Medical University，Chaozhou，Guang⁃dong，China，521021）

［ABSTRACT］Objective To explore the linkage relationship of G6PD c.1311C〉T/IVS⁃11 93T〉Cpoly⁃morphism with the 3′⁃UTR polymorphism in the Chinese population, and investigate the frequency of c.1311C〉T/IVS⁃11 93T〉C polymorphism in healthy individuals in the eastern Guangdong province and northern China. Methods The activity of G6PD enzyme was analyzed through Auto⁃bioanalyzer, and the G6PD c.1311C〉T/ IVS⁃11 93T〉C gene polymorphism was detected by DNA sequencing. Specific primers were designed for ampli⁃fication of the 5′and 3′⁃UTR of the G6PD gene. Results 39 cases of G6PD deficiency were detected with c.1311C〉T/IVS⁃1193T〉C polymorphism in the northern China. However, no variation in the 3′and 5′⁃UTR re⁃gions was found among those samples. At the same time, c.1311C〉T/IVS⁃1193T〉C polymorphism was also de⁃tected in individuals with normal G6PD activity. The frequencies of c.1311C〉T/IVS⁃1193T〉C polymorphism in healthy individuals of Chaozhou and Meizhou area were 15.7% and 12%, respectively. Furthermore, the frequen⁃cy of the polymorphism in healthy individuals of Zhengzhou and Shijiazhuang were 2% and 8% respectively. The frequencies of the polymorphism in healthy individuals were statistically significant in the North and thebook=2,ebook=13South. Conclusion The UTR SNP variations were not found among G6PD deficiency samples detected with c.1311C〉T/IVS⁃1193T〉C gene polymorphism in the eastern Guangdong province. The relationship of G6PD c.1311C〉T/IVS⁃1193T〉C polymorphism with G6PD deficiency requires further study.

［KEY WORDS］G6PD deficiency；Gene mutation；Untranslated regions

基金项目：广东省医学科学技术研究基金（A2014902,B2013444）；广东省临床重点专科建设项目（检验科）（2012）；潮州市科技计划项目（2014S08）

通讯作者：杨立业，E⁃mail: yangleeyee@sina.com