固定化Cu2+螯合亲和膜的制备及螯合性能研究

周茗萱，卢曼怡，管　蓉

(湖北大学 化学化工学院，湖北 武汉 430062)

固定化Cu2+螯合亲和膜的制备及螯合性能研究

周茗萱，卢曼怡，管蓉*

(湖北大学 化学化工学院，湖北 武汉 430062)

摘要：以尼龙66(Nylon 66)膜为基膜，环氧氯丙烷(ECH)为活化剂，壳聚糖(CS)为交联剂，亚胺基二乙酸(IDA)为螯合剂，Cu2+为配位基，制备了固定化Cu2+螯合亲和膜(ICAM膜)，测量了其水通量和孔隙率，研究了IDA的浓度、偶联温度、CuSO4溶液的pH值和初始浓度以及螯合时间对亲和膜螯合Cu2+量的影响，并讨论了该膜螯合Cu2+的机理。结果表明：膜表面有大量孔洞，符合亲和膜的要求；在一定范围内，较高的IDA浓度、较高的CuSO4溶液初始浓度和pH值、较长的螯合时间和较高的螯合温度均有利于ICAM膜对Cu2+的螯合；Freundlich吸附等温模型和准二级动力学模型用于表征该膜对螯合Cu2+的行为具有较好的相关性。

关键词：亲和膜；制备；螯合Cu2+；影响因素

随着生命科学的迅速发展，对生物大分子，如蛋白质、核苷酸、酶、多糖、多肽等分离纯化的要求也越来越高，传统的分离提纯方法很难达到应用目的。固定化金属离子亲和膜是过去 30 年里发展起来的亲和膜技术，借助分离膜渗透性好的优点，可以在较低的操作压和较高的流速下快速地分离和纯化生物大分子[1]，其根本原理是膜与大分子之间配位键的形成与解离。由于蛋白质表面的氨基酸类电子供体可与过渡金属离子形成配位复合物[2]，对于分别螯合有Cu2+、Zn2+、Fe2+、Fe3+和Ni2+亚氨基二乙酸型亲和膜来说，Cu2+-IDA对蛋白质或氨基酸的亲和力最强[3]，所以将Cu2+固定在亲和膜上制成Cu2+螯合亲和膜，可用于蛋白质等生物大分子的分离纯化。目前，固定化金属螯合亲和膜所选用的基膜以纤维素和壳聚糖等天然高分子材料居多，但该类材料的机械强度和化学稳定性较差，在实际应用中并不理想。Nylon 66价廉易得、孔径均匀、化学和机械稳定性能良好，但该膜缺乏活性官能团，不满足亲和分离的需要。本文经综合考虑后，选择Nylon 66作为基膜材料，并对其进行一系列的改性，制备了固定化Cu2+螯合尼龙亲和膜(Immobilized Cu2+-chelated Affinity Membrane, ICAM)，并研究了该膜对Cu2+的螯合行为和作用机理。

1实验

1.1主要仪器及原料

722N可见分光光度计，上海仪电分析仪器有限公司；JSM6510LV扫描电子显微镜，日本电子株式会社；尼龙66微孔滤膜，海宁市益博过滤器材厂；盐酸、环氧氯丙烷、硫酸铜，均为A.R.级，国药集团化学试剂有限公司；壳聚糖(B.R.)，国药集团化学试剂有限公司；亚氨基二乙酸(B.R.)，南京都莱生物技术有限公司。

1.2实验方法

1.2.1固定化Cu2+螯合亲和膜的制备

将Nylon 66膜用盐酸水解后置于20%的ECH溶液中，用NaOH调节溶液的pH值为11，60 ℃水浴振荡10 h后，再取适量的CS，用1%的CH3COOH溶液配成0.01 g/mL的CS溶液，室温下与膜反应1 h，清洗去除膜表面未反应的CS，再用ECH进行二次活化。称取适量IDA，配成115 mg/mL的溶液，与二次活化膜反应得到二次交联膜，将二次交联膜与CuSO4溶液室温下反应，即可得到固定化Cu2+螯合尼龙亲和膜(ICAM膜)。

1.2.2膜性能测试

在0.5 MPa下收集一段时间内透过ICAM膜的水的体积，按公式J=V/(A*t)计算水通量。式中：J为水通量(cm/min)，V为透过水的体积(mL)，A为有效膜面积(cm2)，t为透过时间(min)。

取一定面积的ICAM膜，测量其厚度，求出膜体积，在去离子水中浸泡72 h后取出，擦去水分后迅速称重，湿膜质量为W1，120 ℃下真空干燥至恒重，称重得烘干后膜的质量W2，由公式ε=(W1-W2)*100%/(V*dw)计算膜的孔隙率。式中：ε为孔隙率(%)，W1为湿膜的质量(g)，W2为干膜的质量(g)，V为膜的体积(cm3)，dw为水的密度(g/cm3)。

1.2.3螯合Cu2+量的影响因素

按文献[4]的方法作Cu2+浓度-吸光度标准曲线，研究IDA的浓度、偶联温度、CuSO4溶液的pH值、Cu2+初始浓度和螯合时间对ICAM膜螯合Cu2+量的影响。

1.3吸附等温式

为了研究ICAM膜对Cu2+的螯合机理，本文使用Langmuir、Freundlich、D-R三种吸附等温式来描述ICAM膜对Cu2+的螯合[5]。吸附条件：25 ℃，pH值为6.0，吸附时间2 h，CuSO4溶液的浓度为0.05～0.20 mg/mL。三种吸附等温式如下：

① Langmuir吸附等温式公式为：

1/qe=1/qm+Kd/(Ceqm)

(1)

② Freundlich吸附等温式为：

lgqe=lgKF+(1/n)/lgCe

(2)

③ D-R吸附等温式为：

lnqe=ln X′m - K′ε2

(3)

1.4吸附动力学

将准一级和准二级动力学模型分别用于研究Cu2+在ICAM膜上的吸附动力学。吸附条件：25 ℃，pH值为6.0，吸附时间5～50 min，CuSO4溶液的浓度为0.20 mg/mL。两种动力学方程如下：

①准一级动力学方程表达式为:

ln(qe-q)=lnqe-k1t

(4)

②准二级动力学方程表达式为:

(5)

式中：qe为理论平衡吸附量(mg/g)；q 为t时刻时ICAM膜对BSA的吸附量(mg/g)；t 为吸附时间(min)；k1为准一级吸附速率常数(min-1)；k2为准二级吸附速率常数(min-1)。

2结果与讨论

2.1膜性能

计算得到ICAM膜的平均水通量为5.431 cm/min，平均孔隙率为56.85%，表明膜经过一系列改性后形成了大量孔洞。

2.2BSA标准曲线

图1为Cu2+浓度-吸光度标准曲线。在可见分光光度计上于760 nm处测量0.002 5～0.025 mol/L的CuSO4溶液的吸光度，作浓度-吸光度的标准曲线。测量未知浓度CuSO4溶液的吸光度，通过该标准曲线方程可计算出该溶液的浓度。

图1　Cu2+浓度-吸光度标准曲线

2.3IDA浓度对Cu2+螯合量的影响

配置不同浓度的IDA溶液，将二次交联膜分别放入溶液中，25 ℃水浴10 h。清洗干净后将膜置于0.10 mol/L CuSO4溶液中(pH值为5.0)，25 ℃反应2 h，计算膜上Cu2+螯合量。如图2所示，膜上Cu2+的螯合量随IDA浓度的增大而不断增多，当IDA浓度为115 mg/mL时，螯合量达到最大值；继续增加IDA的浓度，Cu2+螯合量不再增多。这是由于经过处理之后的Nylon 66膜上能与IDA反应的基团是有限的，IDA能与膜反应的量也是有限的，因而膜上能螯合的Cu2+的量也最终达到饱和。

图2　IDA浓度对Cu2+螯合量的影响

2.4偶联温度对Cu2+螯合量的影响

取适量115 mg/L的IDA溶液，放入二次活化膜，分别在不同的温度下水浴反应10 h，其他条件同2.3。如图3所示，Cu2+螯合量随反应温度的升高而不断增多，当温度为50 ℃时，Cu2+螯合量为16.097 mg/g；温度继续升高，Cu2+螯合量减少，故IDA与膜的反应较优温度为50 ℃。

图3　IDA偶联温度对Cu2+螯合量的影响

2.5CuSO4溶液pH值对Cu2+螯合量的影响

取适量115 mg/L的IDA溶液，50 ℃下与二次活化膜反应，制得二次交联膜，25 ℃下分别置于0.1 mol/L不同pH值(2.0、3.0、4.0、5.0、6.0)的CuSO4溶液中2 h。由于Cu2+与OH-会反应，故pH值最大为6.0。pH值对Cu2+螯合量的影响如图4所示。

图4　CuSO4溶液pH对Cu2+螯合量的影响

由图4可知，Cu2+螯合量随溶液pH的增加而增大，在pH值为6.0时，螯合量达到了最大。这是由于在pH值较低的溶液中，H+浓度较高，膜表面大量的正电荷产生了静电排斥作用，降低了膜上Cu2+吸附量。当pH值增加时，H+浓度降低，静电排斥作用随H+浓度减少而降低，膜上裸露出更多带负电的Cu2+结合位点，导致Cu2+螯合量增多[5]。故螯合Cu2+的较优pH值为6.0。

2.6Cu2+初始浓度对Cu2+螯合量的影响

取不同浓度的硫酸铜溶液，将二次活化膜放入溶液中，在25 ℃、pH值为6.0时吸附2 h。Cu2+浓度对Cu2+螯合量的影响见图5。

图5　Cu2+初始浓度对Cu2+螯合量的影响

由图5可知，Cu2+在膜上的螯合量随Cu2+初始浓度的增加而增大，并在Cu2+浓度为0.20 mg/mL时达到最大。这是由于高的Cu2+初始浓度提供了高的驱动力来克服溶液和膜之间的传质阻力；而当Cu2+浓度进一步增大时，螯合量不再变化，这是因为膜上与Cu2+结合的活性位点是有限的。

2.7螯合时间对Cu2+螯合量的影响

取pH值为6.0、浓度0.20 mg/mL的CuSO4溶液在25 ℃下用二次交联膜吸附，每隔一段时间取一次样，计算膜上吸附Cu2+的量，螯合时间对吸附量的影响如图6所示。由图6可知，Cu2+的吸附十分迅速，在40 min时达到最大，此后螯合量基本不变。因此，最优螯合时间为40 min。

图6　螯合时间对Cu2+螯合量的影响

2.8吸附等温式

按照公式(1)、(2)和(3)，分别以1/qe对1/Ce作图、以lgqe对lgCe作图和以lnqe对ε2作图，得到Langmuir吸附等温线、Freundlich吸附等温线和D-R吸附等温线，如图7中a、b、c所示，对三种吸附等温式进行比较，以此来分析ICAM膜对Cu2+的螯合机理。

由图7可知，Freundlich吸附等温式的线性相关系数更接近1，表明Cu2+在二次交联膜上的螯合更符合Freundlich吸附等温行为。

图7　三种吸附等温线

2.9吸附动力学

按照公式(4)、(5)，分别以ln(qe-q)对t作图，以t/q对t作图，得到准一级动力学模型和准二级动力学模型，如图8中a、b所示。

对比两种动力学模型，准二级动力学模型的相关系数R2比准一级动力学模型更接近1，且理论吸附量qe更接近实验值，表明本吸附体系的动力学分析更适合准二级动力学模型。

图8　准一级和准二级动力学模型

3结论

本文制备的ICAM膜具有大量均匀孔洞和较大的比表面积，符合ICAM膜的要求。在一定范围内，随着IDA的浓度、CuSO4溶液初始浓度、pH值、螯合时间和螯合温度的增加，ICAM膜对Cu2+的螯合量增加；Freundlich吸附等温模型和准二级动力学模型用于表征该膜对Cu2+的螯合具有较好的相关性。

[参考文献]

[1]瞿亮，张国亮，张凤宝，等. 聚丙烯膜接枝改性亲和膜的制备与表征[J].高校化学工程学报，2006，20(4)：538-543.

[2]Porath J，Olin B. Immobilized metal ion affinity adsorption and immobilized metal ion affinity chromatography of biomaterials：Serum protein affinities for gel-immobilized iron and nickel ions[J].Biochemistry，1983(22)：1621-1630.

[3]Hari P R，Willi P，Chandra P.Adsorption of human IgG on Cu2+-immobilized cellulose affinity membrance: Preliminary study[J].Biomed Mater Res，2000(50)：110-113.

[4]Sedmak J J，Grossberg S E.A rapid, sensitive, and versatile assay for protein using coomassie brilliant blue G250[J].Analytical Biochemistry，1977，79(1)：544-552.

[5]Simsek I，Karatas M，Basturk E. Cu(II) removal from aqueous solution by ureolytic mixed culture (UMC)[J].Colloids and Surfaces B：Biointerfaces，2013，102(1)：479-483.

(责任编辑：张凯兵)

Research on Preparation and Chelation Property of Immobilized Cu2+-Chelated Affinity Membrane

Zhou Mingxuan, Lu Manyi, Guan Rong*

(SchoolofChemistryandChemicalEngineering,HubeiUniversity,Wuhan,Hubei430062,China)

Abstract：An immobilized Cu2+chelated affinity membrane was prepared by using Nylon 66 membrane as substrate membrane, epichlorohydrin(ECH) as activating agent, chitosan(CS) as crosslinker, iminodiacetic acid(IDA) as coupling agent and copper ion as immobilized metal ion. The porosity and water flux of immobilized Cu2+chelated affinity membrane was investigated, and then the effects of the concentration of IDA, coupling temperature, pH value and initial concentration of CuSO4 solution, and the chelating time of the chelation were also examined. In addition, the chelation mechanism of Cu2+was discussed. The results showed that there were a large number of uniform holes in the immobilized Cu2+chelated affinity membrane, which indicated that the prepared membrane could meet the requirements of the affinity membrane. Besides, the high concentration of IDA, the coupling temperature, the pH value, the initial concentration of CuSO4 solution and long chelation time were all favorable to chelate Cu2+in a certain range. The Freundlich isotherm could describe the chelation behavior of Cu2+and the pseudo-second-order kinetic model could provide the better correlation for the experimental results.

Key Words：affinity membrane; preparation; Cu2+chelated; influence factors

收稿日期：2016-03-02

作者简介：周茗萱(1993-)，女，湖北孝感人，湖北大学化学化工学院硕士研究生。

中图分类号：TQ028.8

文献标志码：A

文章编号：2095-4824(2016)03-0005-05

卢曼怡(1990-)，女，湖北宜昌人，湖北大学化学化工学院硕士研究生。

管蓉(1956-)，女，四川宜宾人，湖北大学化学化工学院教授，本文通信作者。