异种去细胞肌腱的制备及其生物相容性的实验研究

李军　徐宝成　王茂荣　伍盛为

【摘要】 目的 分析异种去细胞肌腱的制备及其生物相容性的实验研究。方法 选取3只健康家猪， 并进行选择性的去细胞异种皮， 同时选取成年Wistar大鼠70只与成年SD大鼠5只， 进行选择性的去细胞异种皮， 并在术后进行组织学观察。结果 对选择性去细胞异种皮与组织学进行观察后得知， 大体观察表现为表皮层较为连续完整， 其表皮面与真皮面分别为黄白色与瓷白色， 较为柔软；进行皮下植入实验后得知， 对其进行大体观察后显示实验动物手术顺利完成， 术后活动良好， 手术切口无肿胀、渗液渗出等情况。结论 采取戊二醛-胰蛋白酶-去污剂制备选择性去细胞异种皮具有良好的生物相容性与形态学优势， 可有效修复大面积深度烧伤的创面， 临床意义显著。

【关键词】 生物相容性；异种去细胞肌腱；制备；实验

DOI：10.14163/j.cnki.11-5547/r.2016.28.195

对于大面积深度烧伤的患者来说， 其自体皮源十分匮乏， 目前临床上较为有效的一类治疗方案为自体微粒皮移植手术[1]。其中选择性去细胞异种皮可帮助患者诱导细胞生长分化， 并有效保护创面， 将该项技术用于修复深度烧伤创面患者的临床意义显著。本次研究采取动物实验方案， 并取得了十分显著的应用效果， 具体报告如下。

1 材料与方法

1. 1 动物与主要试剂 选取3只健康白色家猪， 平均体重（76±8）kg， 成年Wistar大鼠70只， 平均体重（252±14）g， 成年SD大鼠5只， 平均体重（258±12）g， 主要试剂包括25%的戊二醛、胰蛋白酶、小鼠成纤维细胞等。

1. 2 实验方法

1. 2. 1 将家猪处死后去毛， 并将大张全厚皮剥离后去除脂肪， 将戊二醛稀释至0.1%， 对表皮面连续固定60 min， 反复冲洗后削为0.4～0.8 mm厚的断层皮片， 并采用新洁尔灭连续浸泡15 min， 采用生理盐水反复进行清洗， 给予0.25%的胰蛋白酶消化30 min（37℃）， 并置入TritonX-100溶液内持续进行震荡24 h， 将其反复进行冲洗后置入冰箱内（4℃）保存， 并将包含庆大霉素的生理盐水连续浸泡24 h， 并且每隔6 h换取1次液体， 将其进行封装、辐照消毒并保存。对表皮的保留情况、皮片颜色、质地等进行严密观察， 将选择性去细胞异种皮置于甲醛溶液内（4%）进行固定， 并用石蜡进行包埋、切片、HE染色处理等， 对表皮结构、纤维变化情况等进行严密观察， 同时将新鲜的猪皮进行对照观察。

1. 2. 2 5只成年SD大老鼠， 在手术前24 h对背部进行备皮处理， 将氯胺酮与速眠新进行混合后对腹腔进行注射麻醉处理， 并在大鼠的背部切取全层皮肤， 将其置于生理盐水内备用。70只成年Wistar大鼠， 依据背部皮下植入材料的不同分为1组、2组、3组， 其中1组选择性去细胞异种皮， 2组植入新鲜的猪皮， 3组植入大鼠的异体皮， 并在术前的24 h选择背部备皮， 将全层的皮肤切开， 将皮下组织进行分离后制备皮下囊， 并植入皮片内对切口进行缝合处理， 手术完成后的1、2、4、8、12、16周将大鼠的皮肤切开进行观察， 观察大鼠的皮片与周围组织的粘连情况， 并进行HE染色处理， 对移植区域的炎性反应程度与新生血管、纤维基质细胞长入情况进行观察分析。

对其进行炎性反应分级， 分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ级。其中Ⅰ级表示试样的周围无淋巴细胞或者极少量的淋巴细胞；Ⅱ级表示表示出现少量的淋巴细胞；Ⅲ级表示出现少量的中性粒细胞、巨细胞反应、淋巴细胞浸润等；Ⅳ级表示试样周围伴有以中性粒细胞浸润为主的炎性反应。

2 结果

2. 1 对选择性去细胞异种皮与组织学进行观察后得知， 大体观察表现为表皮层较为连续完整， 其表皮面与真皮面分别为黄白色与瓷白色， 较为柔软。

2. 2 进行皮下植入实验后得知， 对其进行大体观察后显示实验动物手术顺利完成， 术后活动良好， 手术切口无肿胀、渗液渗出等情况。

3 讨论

进行微粒皮移植时， 需要采取暂时性的覆盖物进行保护， 较为常见的覆盖物包括新鲜猪皮与异体皮， 其中异体皮可以使得大面积烧伤的治愈率得到明显的提高， 临床应用价值显著， 但是关于异体皮的来源受限较多， 且对于传播病变的微生物可能性难以进行彻底的消除， 所以说， 其临床应用受限[2]。而新鲜的猪皮具有价格经济、来源广泛等特点， 但是发生移植后将出现较早时间的排斥反应， 并且当创面愈合后优于真皮取法将使得功能于外观均不佳。因此， 针对上述问题， 本次研究提出选择性去细胞异种皮的概念， 并将其与自体微粒皮进行有效结合， 将其覆盖深度的烧伤创面将得到较为显著的应用效果。

本次研究选择戊二醛-胰蛋白酶-去污剂进行进行选择性去细胞异种皮实验， 相比以往的临床研究得知， 其中戊二醛的浓度有所下降， 同时胰蛋白酶的作用时间缩短， 将戊二醛作用于表皮面可以助于渗入表皮层， 并产生氨基酸残基反应， 使得胶原分子能够与氨基酸侧链产生交联作用， 将抗原部位进行有效遮蔽， 使得胶原分子之间的稳定性与张力有所提高。其中胰蛋白酶抗原溶解部分真皮层的基质， 使得细胞间隙较为疏松， 并帮助破坏细胞的完整性， 使得胰蛋白酶作用时间缩短， 利于将表皮结构完整进行保留。而非离子型表面活性剂可以与细胞膜磷脂进行结合， 并达到去污、脱细胞的效果[3， 4]。

本次研究结果显示， 对选择性去细胞异种皮大体观察表现为表皮层较为连续完整， 其表皮面与真皮面分别为黄白色与瓷白色， 较为柔软；进行皮下植入实验后得知， 实验动物手术顺利完成， 术后活动良好， 手术切口无肿胀、渗液渗出等情况。

综上所述， 采取戊二醛-胰蛋白酶-去污剂制备选择性去细胞异种皮具有良好的生物相容性与形态学优势。

参考文献

[1] 聂继平， 温树正， 白志刚， 等. 去细胞异种肌腱复合IGF-Ⅰ修复肌腱缺损的实验研究. 中华临床医师杂志（电子版）， 2013， 7（17）：95-99.

[2] 王卉丽. 间充质干细胞（MSC）亲和肽绑定胶原支架促进猪急性全层创面愈合的研究. 南京大学， 2014.

[3] 陈元良. 异种脱细胞肌腱鼻充填材料的生物相容性研究. 南方医科大学， 2012.

[4] 武龙. 小肠黏膜下层细胞外基质水凝胶的制备及其对肝组织损伤修复的影响. 苏州大学， 2015.

[收稿日期：2016-09-21]